CRISPR) — гэта метад рэдагавання геному трэцяга пакалення: CRISPR зрабіў рэвалюцыю ў свеце.

CRISPR (кластарныя рэгулярна размешчаныя кароткія паліндромныя паўторы) — гэта метад рэдагавання геному трэцяга пакалення, які зрабіў рэвалюцыю ў свеце дзякуючы сваім высокапрадукцыйным вынікам. Ён выкарыстоўваецца для лячэння розных біялагічных захворванняў і інфекцый. Розныя бактэрыі і іншыя пракарыёты (напрыклад, археі) таксама маюць сістэмы CRISPR/Cas9 для абароны ад фагаў. Паведамлялася, што стратэгіі на аснове CRISPR/Cas9 могуць стрымліваць рост і прагрэсаванне трайнога негатыўнага рака малочнай залозы (TNBC), накіраваўшыся на патэнцыйна змененыя гены рэзістэнтнасці, транскрыпцыю і эпігенетычную рэгуляцыю. Гэтыя тэрапеўтычныя ўмяшанні могуць дапамагчы ў вырашэнні складаных праблем, такіх як лекавая ўстойлівасць, якая назіраецца нават пры TNBC. У цяперашні час для дастаўкі CRISPR/Cas9 да клетак-мішэняў выкарыстоўваюцца розныя метады, такія як фізічныя (мікраін'екцыя, электрапарацыя і гідрадынамічныя рэжымы), вірусныя (адэнаасацыяваны вірус і лентывірус) і невірусныя (ліпасомы і ліпідныя наначасціцы). Нягледзячы на ​​тое, што для вывучэння малекулярных прычын TNBC былі распрацаваны розныя мадэлі, адсутнасць адчувальных і мэтанакіраваных метадаў для выкарыстання інструментаў рэдагавання геному in vivo абмяжоўвае іх клінічнае прымяненне. Карацей кажучы, у гэтым аглядзе ўсебакова разглядаюцца прагрэс, праблемы, абмежаванні і перспектывы лячэння TNBC з дапамогай CRISPR/Cas9 на аснове існуючых доказаў. Мы таксама падкрэсліваем, як спалучэнне штучнага інтэлекту і машыннага навучання можа палепшыць стратэгіі CRISPR/Cas9 у лячэнні TNBC.
Рак характарызуецца некантраляваным дзяленнем клетак, парушэннем кантрольных кропак клеткавага цыклу і мутацыямі ў генах-супрэсарах пухлін (TSG) (Matthews et al., 2022). Сярод розных тыпаў раку рак малочнай залозы з'яўляецца найбольш распаўсюджаным тыпам раку ў жанчын і мае высокі ўзровень смяротнасці ва ўсім свеце (Waks and Winer, 2019). Рак малочнай залозы - гэта гетэрагеннае захворванне з разнастайнымі характарыстыкамі, такімі як гісталагічныя і біялагічныя асаблівасці, клінічная карціна і паводзіны, а таксама рэакцыя на лячэнне (Weigelt et al., 2010). Класіфікацыя раку малочнай залозы дае дакладную інфармацыю для дыягностыкі раку малочнай залозы і прагнозу пухліны. Выкарыстанне агульных біямаркераў і клініка-паталагічных асаблівасцей было асноўным крытэрыем для класіфікацыі раку малочнай залозы (Tsang and Tse, 2019). На прагноз і рэакцыю на лячэнне раку малочнай залозы ўплываюць шматлікія фактары, у тым ліку наяўнасць рэцэптара эстрагену (ER), рэцэптара прогестэрону (PR), рэцэптара 2 эпідэрмальнага фактару росту чалавека (HER2/neu), а таксама гісталагічная ступень, тып і ступень пухліны, памер і метастазы ў лімфатычныя вузлы (Al-Tubaiti, 2020). Было выяўлена пяць унутраных малекулярных падтыпаў рака малочнай залозы, у тым ліку люмінальны А, люмінальны В, узбагачаны HER2, базальнападобны і з нізкім утрыманнем клаўдзіну (Prat et al., 2015). TNBC - гэта малекулярны падтып раку, які не экспрэсуе ўсе ER, PR і HER2 (Yin et al., 2020). Гэтыя паталагічныя асаблівасці звязаны з TNBC, што пацвярджае яго хуткае прагрэсаванне і больш агрэсіўны характар, чым любы іншы тып раку малочнай залозы (Feng et al., 2018). Акрамя таго, Peru et al. (2000) выкарысталі тэхналогію мікрачыпаў для перакласіфікацыі раку малочнай залозы і вызначэння пяці ўнутраных падтыпаў раку малочнай залозы (Cadenas, 2012). Базальнападобны рак малочнай залозы - гэта падтып раку малочнай залозы, які мае трайны негатыўны фенатып і звязаны з хуткім прагрэсаваннем. Варта адзначыць, што ўсе базальнападобныя ракі малочнай залозы часта памылкова дыягнастуюцца як TNBC, але толькі 77% з іх з'яўляюцца TNBC; У адрозненне ад гэтага, 71–91% выпадкаў TNBC маюць базальную форму, што сведчыць аб тым, што гэтыя два тыпы раку малочнай залозы перасякаюцца і прадстаўляюць розныя класіфікацыі (Wang D.-Y. et al., 2019). Гэта стварае неабходнасць характарызаваць гетэрагеннасць TNBC для высвятлення прагнозу і вызначэння патэнцыйных рэакцый на бягучае і будучыя метады лячэння. Акрамя таго, TNBC складае 15–20% усіх выпадкаў раку малочнай залозы і часцей сустракаецца ў жанчын ва ўзросце да 50 гадоў. Мутацыі BRCA1 або BRCA2 былі выяўлены прыблізна ў 20% выпадкаў TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). Даследаванні таксама паказалі, што TNBC мае адметнае імуннае мікраасяроддзе, якое ўключае высокі ўзровень фактараў росту эндатэлія сасудаў, пухлінна-асацыяваных макрафагаў (TAM), пухлінна-інфільтруючых лімфацытаў (TIL) і іншых малекул, якія ўдзельнічаюць у росце і міграцыі пухліны. Такім чынам, разуменне мікраасяроддзя TNBC мае вырашальнае значэнне для яго прагнозу і лячэння (Fan and He, 2022).
Для ацэнкі прагнозу TNBC і забеспячэння эфектыўнага лячэння важная дакладная дыягностыка, заснаваная ў асноўным на імунагістахіміі (IHC) для выяўлення ER, PR і HER2, а таксама мамаграфія для выяўлення наватвораў малочнай залозы. Аднак мамаграфія не можа належным чынам адлюстраваць унутрыпухлінныя асаблівасці, такія як некроз і фіброз (Deepak Singh et al., 2021). Паколькі дрэнны прагноз і дыягностыка перашкаджаюць лекарам прызначаць правільныя лекі (Chaudhary, 2020), выкарыстоўваюцца розныя стратэгіі для паляпшэння догляду за пацыентамі з TNBC. У цяперашні час у пацыентаў з TNBC выкарыстоўваюцца два прэпараты, доксарубіцын і цыклафасфамід, якія паказалі добрыя вынікі. Акрамя таго, выкарыстоўваюцца іншыя прэпараты плаціны, такія як карбапаліцін і цысплацін (Sikov et al., 2015). Акрамя таго, інгібітары PARP, такія як олапарыб, велапарыб і PF-01367338, выкарыстоўваюцца ў якасці патэнцыйных хіміятэрапеўтычных прэпаратаў для лячэння TNBC (Ishino et al., 2018). Паколькі паведамлялася, што сігнальныя шляхі Wnt/b-Catenin, NOTCH і Hedgehog удзельнічаюць ва ўзнікненні і прагрэсаванні TNBC, мэтавая ўздзеянне лекаў на гэтыя шляхі можа быць важнай стратэгіяй (Aysola et al., 2013). Нягледзячы на ​​тое, што хірургічнае ўмяшанне, прамянёвая тэрапія і хіміятэрапія застаюцца асноўнымі метадамі лячэння TNBC сёння, значны прагрэс быў дасягнуты ў распрацоўцы новых метадаў лячэння, уключаючы мэтавую тэрапію, імунатэрапію, розныя інструменты рэдагавання генаў, звязаныя з CRISPR, такія як Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing і генную тэрапію, накіраваную на CRISPR/Cas9. Тут мы засяродзімся на розных інструментах рэдагавання генаў, звязаных з CRISPR, якія выкарыстоўваюцца ў лячэнні TNBC. Сярод іх CRISPR/Cas9 прыцягнуў шырокую ўвагу.
Cas9n, таксама вядомы як ніказа Cas9, — гэта генетычна мадыфікаваны варыянт бялку Cas9, атрыманы з дапамогай сістэмы рэдагавання геному CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). У сваёй першапачатковай форме бялок Cas9 змяшчае два нуклеазныя дамены: RuvC і HNH, асноўная функцыя якіх — расшчапленне абедзвюх нітак ДНК. Аднак у Cas9n адзін з нуклеазных даменаў, HNH, генетычна мутуецца і становіцца неактыўным. Такім чынам, дамен HNH Cas9n застаецца нефункцыянальным. Актыўным застаецца толькі дамен RuvC, што дазваляе Cas9n разразаць або ствараць разрывы на асобных нітках ДНК (Trevino and Zhang, 2014). У параўнанні з Cas9, Cas9n можа эфектыўна памяншаць пазацэлевыя эфекты і дакладна паляпшаць механізмы аднаўлення клетак. Cas9n можа быць выкарыстаны для вырашэння розных праблем, такіх як стварэнне разрываў у пэўных месцах двухланцуговай ДНК. Для гэтай мэты дзве малекулы Cas9n былі аб'яднаны і выкарыстаны разам (Yee, 2016). Змяшаная лінія кіназы 3 (MLK3) — гэта мітоген-актываваная пратэінкіназа, якая служыць ключавым рэгулятарам падчас метастазіравання TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 можа актываваць некалькі сігнальных шляхоў, якія прыводзяць да метастазіравання TNBC. Напрыклад, шлях N-канцавой кіназы c-Jun (JNK) рэгулюе рухомасць клетак і дэградацыю пазаклеткавага матрыкса, а MLK3 актывуе шлях JNK, тым самым паляпшаючы рухомасць клетак і надаючы ім інвазіўныя ўласцівасці (Rattanasinchai and Gallo, 2016). MLK3 таксама рэгулюе эпітэліяльны мезенхімальны транскрыпцыйны сігнал (EMT). Для гэтага ён актывуе транскрыпцыйныя фактары ніжэй па плыні, такія як Snail, Slug і Twist. Гэтыя фактары інгібіруюць экспрэсію эпітэліяльных маркераў і спрыяюць экспрэсіі мезенхімальных маркераў, што прыводзіць да набыцця метастатычнага фенатыпу (Casalino et al., 2023). Было заўважана, што MLK3 адыгрывае ролю ў рэмадэляванні пазаклеткавага матрыкса і актывацыі пратэаз, такіх як матрыксныя металапратэіназы (MMP), якія дэградуюць пазаклеткавы матрыкс. Гэта спрыяе інвазіі пухлінных клетак і іх распаўсюджванню ў аддаленыя ўчасткі (Katari et al., 2019). Такім чынам, папярэднія даследаванні паказалі, што MLK3 адыгрывае важную ролю ў TNBC. Ратанасінчай і Гало выкарысталі мадэлі TNBC для вывучэння ролі MLK3 і выявілі, што ён спрыяе развіццю раку праз пэўныя сігнальныя шляхі. Яны выкарысталі CRISPR/Cas9n для рэдагавання MLK3 і назіралі значнае зніжэнне метастазіравання TNBC (Rattanasinchai and Gallo, 2016).
dCas9, які часта называюць неактыўным Cas9, з'яўляецца мадыфікаванай вытворнай формай бялку Cas9. У адрозненне ад актыўнага Cas9, dCas9 не мае эндануклеазнай актыўнасці, што робіць яго не здольным выклікаць двухланцуговыя разрывы ДНК. Такім чынам, dCas9 можа быць выкарыстаны для дакладнага ўздзеяння на пэўныя вобласці геному без якіх-небудзь змяненняў або мадыфікацый паслядоўнасці ДНК (Wang et al., 2016). У dCas9 два эндануклеазныя бялкі, RuvC і HNH, інактывуюцца шляхам падаўлення важных амінакіслотных рэшткаў. (Richter et al., 2016). Нягледзячы на ​​адсутнасць актыўнасці расшчаплення ДНК, dCas9 адыгрывае шэраг важных роляў у генетычных даследаваннях і біятэхналогіі. Напрыклад, ён дазваляе візуалізаваць пэўныя вобласці геному, палягчае рэгуляцыю транскрыпцыі і спрыяе эпігенетычным мадыфікацыям (Brocken et al., 2018).
Транскрыпцыйны фактар ​​ZEB1 (цынкавы палец, які звязвае E-box homeobox 1) адыгрывае спецыфічную і важную ролю ў апасродкаванні эпітэліяльна-мезенхімальнага пераходу (EMT), клеткавага працэсу, які адбываецца падчас эмбрыянальнага развіцця, аднаўлення тканін і прагрэсавання раку. Ён уключае трансфармацыю эпітэліяльных клетак у мезенхімальныя клеткі, што прыводзіць да змен у марфалогіі клетак, рухомасці, інвазіўнасці і г.д. (Wu et al., 2020). ZEB1 інгібіруе мноства эпітэліяльных маркераў, такіх як E-cadherin і Occludin, якія адказваюць за падтрыманне міжклеткавай адгезіі і палярнасці эпітэліяльных клетак пры TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Акрамя таго, ZEB1 актывуе некаторыя маркеры, такія як N-cadherin, vimentin і фібранекцін (Konradi et al., 2014), а таксама рэгулюе гены, якія ўдзельнічаюць у перабудове цыташкілета, такія як Rho GTPases і матрыксныя металапратэіназы (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), акрамя таго, ён таксама ўплывае на розныя сігнальныя шляхі, такія як трансфармуючы фактар ​​росту-β (TGF-β), сігналізацыя Wnt і г.д., тым самым спрыяючы інвазіі пухліны і метастазаванню пры TNBC (Chen et al., 2016). Шматлікія даследаванні і навуковыя дадзеныя паказваюць, што ZEB1 мае вялікі патэнцыял як каштоўны агент для выяўлення і тэрапеўтычнага ўмяшання пры TNBC. У нядаўнім даследаванні Waryah et al. выкарысталі мадэль TNBC і дасягнулі поўнага падаўлення ZEB1 з дапамогай dCas9. Такім чынам, яны назіралі вельмі высокую спецыфічнасць і амаль поўнае інгібіраванне ZEB1 ва ўмовах in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 — гэта інструмент рэдагавання генаў пад назвай CRISPR/Cpf1. Ён паходзіць ад сістэмы CRISPR/Cas, дзе тэрмін Cas12 адносіцца да CRISPR-асацыяванага бялку 12 (Bharathkumar et al., 2022), які цалкам падобны да Cas9. Адзінае адрозненне заключаецца ў тым, што ён утрымлівае бялок Cas12. У параўнанні з Cas9, Cas12 мае некаторыя унікальныя функцыі, такія як стварэнне ліпкіх канцоў падчас працэсу рэдагавання генаў, тады як Cas9 генеруе тупыя канцы (Wang et al., 2021). Гэтая ўласцівасць Cas12 спрыяе яго спецыфічнай тэхналогіі маніпуляцыі з ДНК. Як бялок, здольны дакладна распазнаваць і разразаць мэтавую ДНК, ён валодае надзвычайнай універсальнасцю, што робіць яго эфектыўным інструментам для розных ужыванняў, у тым ліку для рэдагавання генаў (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
Падобна іншым варыянтам CRISPR, CRISPR/Cas12 таксама здольны выбіваць або актываваць гены ў TNBC, нацэльваючыся на гены, якія адыгрываюць важную ролю ў яго патагенезе або рэакцыі на лячэнне (Yang and Zhang, 2023). Для ажыццяўлення гэтага працэсу была распрацавана накіроўвальная РНК (гРНК), якая накіроўвае Cas12 да мэтавага гена. Пасля таго, як Cas12 звязваецца са сваёй мішэнню, яна ўводзіць двухланцуговыя разрывы ў ДНК і актывуе механізмы рамонту ДНК. Падчас працэсу рамонту могуць быць уключаны няправільныя нуклеатыды, што прыводзіць да генных мутацый і страты функцыі (Zhang et al., 2021a). Акрамя таго, для актывацыі генаў была выкарыстана палепшаная версія фермента Cas12 (так званая dCas12). Спалучаючы яе з актыватарам транскрыпцыі, можна індукаваць пэўныя гены, тым самым актывуючы іх. Гэтая тэхналогія мае вялікі патэнцыял у садзейнічанні актывацыі генаў-супрэсараў пухлін (Sultan et al., 2022).
Прайм-рэдагаванне — гэта нядаўна распрацаваная і надзвычай дасканалая тэхналогія рэдагавання геному. Яна здольная вельмі дакладна мадыфікаваць ДНК арганізма (Chen and Liu, 2023). Прайм-рэдагаванне дасягаецца шляхам інтэграцыі двух асноўных кампанентаў: мадыфікаванага фермента CRISPR/Cas9 і зваротнай транскрыптазы. Роля фермента CRISPR/Cas9 заключаецца ў выбарачным нацэльванні на дакладныя ўчасткі ў геноме, у той час як зваротная транскрыптаза дапамагае грунтоўна мадыфікаваць ДНК у мэтавым месцы (Hassan et al., 2021). У механізме рэдагавання праймераў першы крок уключае стварэнне РНК-накіроўвальніка рэдагавання праймераў (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Яна змяшчае мэтавую паслядоўнасць і шаблон РНК, якія адпавядаюць патрэбнаму сайту рэдагавання ў мэтавай ДНК. Затым pegRNA ўводзіцца ў мэтавыя клеткі разам з нуклеазай рэдагавання праймераў (PE2). PE2 — гэта зліты бялок, які складаецца з фермента Cas9, зваротнай транскрыптазы і адаптара рэдагавання праймераў (Martín-Alonso et al., 2021). Унутры клеткі комплексы pegRNA і PE2 шукаюць спецыфічную ДНК, якую яны хочуць мадыфікаваць. Фермент Cas9 разразае ДНК і стварае шаблон, які складаецца з асобных ланцугоў (Choi et al., 2022). Зваротная транскрыптаза выкарыстоўвае гэты шаблон для падрыхтоўкі ДНК да рэдагавання. Разам з капіраваннем ДНК таксама ўключаны інструкцыі па рэдагаванні шаблону РНК. Нарэшце, новаўтвораны ланцуг ДНК выкарыстоўваецца ў якасці шаблону для рамонту разрыву ў ДНК, што прыводзіць да змененай паслядоўнасці ДНК, якая змяшчае патрэбную мадыфікацыю (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Механізмы рэдагавання праймераў могуць прывесці да шырока распаўсюджаных мутацый у генах. Яны могуць быць накіраваны на кропкавыя мутацыі, устаўкі, дэлецыі і нават замяшчэнне генаў (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Праймернае рэдагаванне прапануе некалькі пераваг у параўнанні з папярэднімі тэхналогіямі рэдагавання геному. Да іх адносяцца павышаная дакладнасць, зніжэнне пазацэлевых эфектаў і магчымасць рэдагаваць ДНК без залежнасці ад двухланцуговых разрываў ДНК (Anzalone et al., 2020).
Тэхналогія CRISPR/Cas9 першапачаткова была распрацавана для абароны бактэрый ад пераносу плазмід і фагавай інфекцыі, а пазней была перапрафілявана ў якасці эфектыўнага інструмента таргетынгу ДНК на аснове РНК для рэдагавання геному (Jiang and Doudna, 2017). Акрамя таго, паведамлялася, што сістэма CRISPR/Cas9 прысутнічае ў 50% і 87% бактэрыяльных і архейных геномаў адпаведна (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 з'яўляецца патэнцыйным інструментам для выдалення, устаўкі і карэкцыі любой анамальнай генетычнай паслядоўнасці з выкарыстаннем рэжымаў in vivo і in vitro (Sabit et al., 2021). Больш за тое, было паказана, што CRISPR/Cas9 з'яўляецца часткай адаптыўнай імуннай сістэмы дзякуючы сваёй спецыфічнасці да мэтавых генаў (Chen and Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 складаецца з Cas9 і адной накіроўвалай РНК (sgRNA). Cas9 — гэта эндануклеаза, якая складаецца з некалькіх бялковых кампанентаў. Акрамя таго, Cas9 мае ўнікальныя структурныя і канфармацыйныя ўласцівасці (Pacesa et al., 2022), бо складаецца з двух доляў: распазнавання (REC) і нуклеазы (NUC). Доля REC далей падзелена на тры вобласці: REC1, REC2 і маставыя спіралі (Cromwell et al., 2018). NUC складаецца з трох доляў, а менавіта RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH і дамена ўзаемадзеяння з пратаспейсерным суседнім матывам (PAM) (мал. 1) (Song et al., 2016). sgRNA складаецца з двух кампанентаў, у тым ліку CRISPR РНК (crRNA) і транскадуючай малой РНК (трасернай РНК) (малюнак 1). sgRNA злучае бялок Cas9 з канексінамі, утвараючы актыўны комплекс, таксама вядомы як эфекторны комплекс (Richter et al., 2012). crRNA — гэта пара асноў з 18–20 нуклеатыдаў, якая адыгрывае важную ролю ў распазнаванні мэтавых паслядоўнасцей ДНК. Акрамя таго, crRNA злучаецца з мэтавай ДНК, а tracrRNA дзейнічае як каркас для нуклеазы Cas9 для звязвання мэтавай ДНК (Manghwar et al., 2019). З іншага боку, паслядоўнасць PAM мае 3 нуклеатыды, што пацвярджае, удакладняе і апасродкуе звязванне эфекторнага комплексу з ДНК. Субадзінкі бялковага комплексу Cas9 RuvC і HNH валодаюць каталітычнай актыўнасцю (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Нуклеазны дамен HNH субадзінкі Cas9 расшчапляе ланцуг ДНК, звязаны з crRNA. Нуклеазны дамен RuvC расшчапляе іншыя ніткі ДНК і генеруе двухланцуговыя разрывы (ДНР), пасля чаго актывуюцца два розныя механізмы рамонту разрываў ДНК (Jiang and Doudna, 2017) (Малюнак 1).
Малюнак 1. Агляд CRISPR/Cas9 (A). Кампаненты сістэмы CRISPR/Cas9: (i). Эндануклеаза Cas9 адказвае за разразанне мэтавай паслядоўнасці ДНК, (ii) адзіная накіроўвальная (sg) РНК, якая ўтвараецца ў выніку зліцця хімер crRNA і tra-crRNA. (два). Cas9 уключае некалькі кампанентаў, такіх як Rec I, Rec II, доля NUC (HNH і Ruv C з'яўляюцца падкампанентамі) і дамен узаемадзеяння PAM (C) з адпаведнымі функцыямі. Бялковы комплекс CRISPR/Cas9 расшчапляе паслядоўнасці ДНК на некамплементарныя і камплементарныя формы (D). CRISPR/Cas9 рэдагуе геном у тры этапы: распазнаванне, разразанне і рамонт. Распрацаваная sg-РНК накіроўвае Cas9 і распазнае патрэбную паслядоўнасць праз камплементарны кампанент crRNA. Cas9 распазнае паслядоўнасць PAM у 5′-NGG-3′ і плавіць ДНК, утвараючы гібрыд ДНК-РНК і актывуючы расшчапленне. Дамен HNH гена Cas9 расшчапляе камплементарны ланцуг, а дамен RuvC — некамплементарны. CRISPR/Cas9 аднаўляе двухланцужковую ДНК, разрываючы яе двума спосабамі: злучэннем негамалагічных канцоў (NHEJ) і гамалагічна-накіраванай рамонтнай працэдурай (HDR). NHEJ аднаўляе двухланцужковую ДНК пры адсутнасці чужароднай гамалагічнай ДНК з дапамогай ферментатыўнага працэсу — схільнага да памылак механізму, які можа ўстаўляць або выдаляць выпадковыя паслядоўнасці ДНК. HDR вельмі спецыфічны і патрабуе гамалагічных шаблонаў ДНК.
Шляхі рамонту, апасродкаваныя CRISPR/Cas9, уключаюць механізмы негамалагічных злучэнняў канцоў (NHEJ) і гамалагічных накіраваных рамонтаў (HDR). NHEJ — гэта шлях, схільны да памылак, паколькі ён уключае ўстаўку або выдаленне і не патрабуе ніякага шаблону падчас механізму рамонту. Ён выкарыстоўвае выпадковыя нуклеатыды для стварэння стандартных бялкоў (Abbasi et al., 2021). Гэтая сістэма рамонту складаецца з чатырох комплексаў, такіх як комплекс KU, перакрыжавана-камплементуючы бялковы комплекс тыпу 4 (XRCC-4), фермент апрацоўкі канцоў ДНК і бялковая кіназа DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Бялок комплексу KU мае дзве субадзінкі, Ku 70 і Ku 80, і адыгрывае важную ролю ў механізме рэпарацыі NHEJ, паколькі механізм рэпарацыі ініцыюецца звязваннем дзвюх субадзінак (Ku 70 і Ku 80) з тупымі або амаль тупымі канцамі мэтавай ДНК (Abbasi et al., 2021), служачы каркасам для прыцягнення іншых фактараў, звязаных з NHEJ, да месца пашкоджання (Yang et al., 2020). XRCC-4 і ДНК-лігаза складаюцца з 334 і 911 амінакіслот адпаведна, а комплекс XRCC4-ДНК-лігазы IV стымулюе лігацыю канцоў ДНК (Chatterjee et al., 2015). Фермент, які апрацоўвае канцы ДНК, таксама вядомы як полінуклеатыдкіназа 3'-фасфат, з'яўляецца ферментам, які апрацоўвае канцы ДНК. Ён можа выдаляць 3'P-групу ў ДНК і фасфараляваць 5'OH-групу падчас рэпарацыі DSB. Гэта таксама ўключае рамонт адналанцуговых разрываў (SSB) з выкарыстаннем шляху рамонту SSB (Chatterjee et al., 2015). Пратэінкіназа DNA-PKcs — гэта ДНК-залежная пратэінкіназа, якая складаецца з каталітычнай субадзінкі сямейства PIKK (фасфатыдыліназітол-3-кіназ-роднасных кіназ) і мутаванай атаксія-тэлеангіэктазіі (ATM), а таксама ATR, звязаных з ATM і Rad3, ланцуговых разрываў (DSB) і адналанцуговых разрываў (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR з'яўляецца больш дакладным і прыдатным механізмам рамонту, паколькі інфармацыя капіюецца з выкарыстаннем непашкоджанай формы гамалагічнага дуплекса ДНК, хоць для гэтага патрабуецца прысутнасць сястрынскіх храматыд. Гэта адбываецца падчас фазы S/G2 клеткавага цыклу млекакормячых. HDR сустракаецца ў асноўным у дрожджавых відаў, але NHEJ мае вырашальнае значэнне для млекакормячых (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Поўны механізм рамонту паказаны на малюнку 1.
Паколькі TNBC выкліканы генетычнымі і эпігенетычнымі анамаліямі, карэкцыя злаякасных геномных/эпігеномных анамалій з дапамогай CRISPR/Cas9 можа быць слушным тэрапеўтычным падыходам (Chen et al., 2019). Акрамя таго, некаторыя транскрыпцыйныя фактары, якія ўдзельнічаюць у клеткава-спецыфічнай транскрыпцыйнай рэгуляцыі, могуць праяўляць унікальныя характарыстыкі ракавых клетак, што сведчыць аб тым, што транскрыпцыйная рэгуляцыя можа быць выдатным падыходам для лячэння раку (Drost et al., 2017). Выкарыстанне гэтых малекулярных асаблівасцей пухлін, такіх як генетычныя, эпігенетычныя і транскрыпцыйныя дэфекты, для распрацоўкі лекаў можа палепшыць клінічныя вынікі і знізіць выдаткі на скрынінг. CRISPR - гэта патэнцыйны інструмент рэдагавання генаў, які можа не толькі выяўляць і ідэнтыфікаваць геномныя мішэні, якія выклікаюць рак, але таксама можа быць выкарыстаны для рэдагавання, падаўлення і эпігенетычнай мадыфікацыі анкагенаў у клетках чалавека (табліца 1) (Ahmed et al., 2021). Было праведзена некалькі скрынінгаў CRISPR для пошуку генаў, звязаных з супрэсарамі пухлін, анкагенамі і лекавай рэзістэнтнасцю. Выкарыстанне CRISPR/Cas9 для рэдагавання розных анкагенаў TNBC паказана на малюнку 2.
Малюнак 2. Рэдагаванне генаў розных анкагенаў TNBC з выкарыстаннем CRISPR/Cas9, якое прыводзіць да зніжэння росту і метастазіравання пухліны. Да гэтых анкагенаў адносяцца CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 і CXCR7, Crypto1, ROR1 і ST8SIA, якія ўдзельнічаюць ва ўзнікненні і метастазіраванні TNBC.
Міграцыя, інвазія і эпітэліяльна-мезенхімальны пераход (ЭМП) ракавых клетак звязаны з ITGA9. Папярэднія даследаванні паказалі, што ITGA9 з'яўляецца ключавым гульцом у шляху Notch і адыгрывае цікавую ролю ў метастазіраванні рабдаміясаркомы (Molist et al., 2020). Акрамя таго, было выяўлена, што ITGA9 цесна звязаны з прагнозам пацыентаў з некалькімі тыпамі пухлін, у тым ліку з ракам малочнай залозы (Wang Z. et al., 2019). Акрамя таго, біяінфарматычны аналіз ITGA9 паказаў, што яго экспрэсія ў TNBC была значна вышэйшай, чым у іншых падтыпах раку малочнай залозы. Павышаны ўзровень ITGA9 звязаны з метастазіраваннем пухліны і рэцыдывам у пацыентаў з TNBC. Накаўт ITGA9 з дапамогай CRISPR/Cas9 прывёў да ўласцівасцей, падобных да ракавых ствалавых клетак (РСК), ангіягенезу пухліны, росту пухліны і зніжэння метастазіравання шляхам садзейнічання дэградацыі β-катэніну ў TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Крыпта-1 належыць да сямейства TGF-β і мае вырашальнае значэнне для ранняга эмбрыягенезу, падтрымання ствалавых клетак і метастазіравання раку (Ishii et al., 2021). Таксама вядомы як Tdgf-1, гэта анкагенны сігнальны бялок, звязаны з GPI, які ўдзельнічае ў рэгуляцыі фарміравання першаснай паласы, мезадэрмы і эндадэрмы, а таксама ва ўстанаўленні левай/правай асіметрыі ў развіцці органаў цела падчас эмбрыягенезу (Zhang et al., 2021b). Акрамя таго, было паказана, што Крыпта-1 удзельнічае ў эпітэліяльна-мезенхімальным пераходзе (EMT) у якасці маркера ствалавых клетак (Zhang et al., 2021b). EMT мае вырашальнае значэнне не толькі для розных працэсаў, такіх як эмбрыянальнае развіццё, фіброз і гаенне ран, але і для інвазіі і метастазіравання раку. Акрамя таго, было паказана, што Крыпта-1 узаемадзейнічае з чатырма рэцэптарамі Notch і ўзмацняе іх посттрансляцыйнае паспяванне (Brandstadter and Maillard, 2019). Вядома, што сігнальны шлях Notch удзельнічае ў падтрыманні клетак рака малочнай залозы чалавека. Даследаванні паказалі, што накаўт Crypto-1, апасродкаваны CRISPR/Cas9, падаўляе рост і метастазаванне раку. Такім чынам, Crypto-1 можа стаць важнай тэрапеўтычнай мішэнню для TNBC (Castro et al., 2015).
Бялок XCL12 і яго хемокінавы рэцэптар CXC (CXCR4 і CXCR7) гуляюць розныя ролі ў праліферацыі, росце, міграцыі і інвазіі ракавых клетак (Wu et al., 2015). Гэтыя хеморецэптары былі звязаны з развіццём TNBC праз некалькі сігнальных шляхоў як у мадэлях in vivo, так і in vitro (Wu et al., 2015). Акрамя таго, актывацыя CXCR4 і CXCR7 звязана з большай успрымальнасцю да метастазіравання і дрэнным прагнозам пры TNBC (Karn et al., 2022). Такім чынам, накаўт CXCR4 і CXCR7 можа стаць эфектыўнымі генамі-мішэнямі для лячэння рака малочнай залозы, у тым ліку TNBC. Даследаванне Yang et al. У даследаванні Yang et al. (2019) выкарыстоўваўся CRISPR/Cas9 для сумеснага накаўту генаў CXCR4 і CXCR7, і было выяўлена, што праліферацыя, рост, міграцыя і інвазія TNBC былі значна інгібіраваны (Yang et al., 2019).
Павышаны ўзровень miR-3662, анкагена TNBC, назіраўся ў тканінах рака малочнай залозы (Yi et al., 2022). Было паказана, што накдаўн miR-3662 інгібіруе рост і метастазаванне пухліны рака малочнай залозы як in vivo, так і in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 з'яўляецца магутным інгібітарам сігналізацыі Wnt/-катэніну і, верагодна, адказвае за рост клетак TNBC, апасродкаваны miR-3662. Нядаўна Yi і інш. выявілі, што вось miR-3662-HBP1 рэгулюе сігнальны шлях Wnt/-катэніну ў клетках TNBC (Yi et al., 2022). Дзякуючы сваёй пухлінна-спецыфічнай экспрэсіі, miR-3662 можа быць патэнцыйнай тэрапеўтычнай мішэнню для TNBC. Такім чынам, накдаўн miR-3662, апасродкаваны CRISPR/Cas9, можа быць выдатным падыходам для распрацоўкі новых лекаў для лячэння TNBC.
UBR5 — гэта нуклеафосфапратэін з масай 300 кДа, які быў ідэнтыфікаваны як ключавы рэгулятар тумарыгенезу, метастазіравання і імуннай рэакцыі пры розных відах раку (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Паведамлялася, што UBR5 значна павышаецца ва ўзорах TNBC і стымулюе функцыю ERα, індукуючы праліферацыю праз сваю ўбіквіцінлігазную актыўнасць (Bolt et al., 2015). Даследаванні поўнага экзомнага секвенавання першасных узораў TNBC таксама паказалі павышаную экспрэсію UBR5, што сведчыць пра яго ролю ў развіцці TNBC. Акрамя таго, дэлецыя UBR5, выкліканая CRISPR/Cas9, паказала значнае інгібіраванне метастазіравання і росту TNBC у эксперыментальных мадэлях мышэй. Больш за тое, уключэнне UBR5 у мадэль мышэй дзікага тыпу аднавіла яго поўную функцыянальнасць, тады як гэты эфект не назіраўся ў інактываваных мутантных штамах (Liao et al., 2017). Адсутнасць UBR5 асацыюецца з павелічэннем апоптозу, некрозу і інгібіравання росту пухліны пры TNBC з-за дрэннага ангіягенезу. З-за страты UBR5 распаўсюджванне пухліны ў аддаленыя органы памяншаецца, і UBR5 выклікае анамальны ЭМП, галоўным чынам за кошт зніжэння экспрэсіі Е-кадгерыну (Zhang and Weinberg, 2018). Нядаўна было паказана, што UBR5 з'яўляецца вельмі важным фактарам у транскрыпцыі PDL1, індукаванай IFN-γ, пры TNBC з-за адсутнасці ўбіквіцініруючай актыўнасці E3. Аналіз РНК-транскрыптома паказаў, што UBR5 можа аказваць сістэмнае ўздзеянне на гены, звязаныя са шляхам IFN-γ, і спрыяць трансактывацыі PDL1, павялічваючы ўзровень актывацыі бялковай кіназы РНК (PKR) і яе сігнальных пераўтваральнікаў і актыватараў транскрыпцыі 1 (STAT1) і рэгуляторнага фактару інтэрферону 1 (IRF1). Аднак камбінаваная абляцыя UBR5 і экспрэсіі PD-L1, апасродкаваная CRISPR/Cas9, мае сінергічны тэрапеўтычны эфект, чым кожная з гэтых блакад паасобку, з глыбокім уздзеяннем на мікраасяроддзе пухліны (Wu et al., 2022). Такім чынам, CRISPR/Cas9 можа быць важным інструментам для інгібіравання функцыі UBR5, тым самым падаўляючы метастазаванне TNBC і рост пухліны.
ROR1 — гэта трансмембранны бялок тыпу I, які экспрэсуецца падчас раку і эмбрыянальнага развіцця і быў ідэнтыфікаваны як анкафетальны бялок (Nicholas Borcherding, 2014). Інвазіўная паводзіны розных відаў раку чалавека звязана з павышэннем рэгуляцыі ROR1. Перспектыўныя вынікі былі атрыманы ў даследаваннях in vivo і in vitro з выкарыстаннем тэрапеўтычных злучэнняў, накіраваных на ROR1 (Chien et al., 2016). Павышаны ўзровень мРНК ROR1 у біяпсіях тканіны малочнай залозы таксама быў звязаны з агрэсіўнымі базальнападобнымі пухлінамі малочнай залозы (BL) і іх міграцыяй у іншыя часткі цела. Больш за тое, празмерная экспрэсія ROR1 была вызначана як прагнастычны маркер развіцця TNBC (Chien et al., 2016). Аднак эфектыўнай стратэгіяй было б прыглушэнне ROR1 з дапамогай CRISPR/Cas9 для падаўлення росту і метастазіравання TNBC.
Працэс сіялілявання ўключае далучэнне сіялавай кіслаты да глікакан'югатаў, якое каталізуецца сіялілтрансферазамі (СТ). ST8SIA1 належыць да сямейства СТ і адыгрывае важную ролю ў патагенезе розных захворванняў, такіх як лімфацытарны лейкоз і каларэктальны рак (Chang et al., 2018). Аналіз паслядоўнасці РНК паказвае, што ST8SIA1 высока экспрэсуецца ў тканіны малочнай залозы пацыентаў з TNBC і станоўча карэлюе з мутацыямі ў гене-супрэсары пухліны p53, што можа спрыяць патагенезу TNBC (Battula et al., 2017). Акрамя таго, ST8SIA1 удзельнічае ў метастазіраванні і рэцыдываванні TNBC, што сведчыць аб яго важнай ролі ва ўзнікненні і развіцці TNBC. У мадэлі TNBC in vitro было паказана, што накдаўн ST8SIA1 з дапамогай CRIPSR/Cas9 блакуе рост і метастазіраванне (Battula et al., 2017). Гэта сведчыць аб тым, што CRISPR/Cas9 можа быць важным інструментам для інгібіравання функцыі анкагена ST8SIA1 пры лячэнні TNBC.
NAT1 — гэта метабалічны фермент, які каталізуе ўтварэнне ксенабіётычных злучэнняў фазы II і экспрэсуецца практычна ва ўсіх тканінах чалавека. NAT1 можа выкарыстоўваць кафактар ​​фолат для ўздзеяння на ацэтыл-КоА (ацэтыл-КоА) нават пры адсутнасці араматычнага амінавага субстрата (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Даследаванні паказалі, што NAT1 рэгулюе функцыю матрыкснай металапратэіназы 9 (MMP9) у мадэлях клетак рака малочнай залозы і абараняе ад актыўных формаў кіслароду (ROS) падчас глюкознага галадання (Wang et al., 2018). Было паказана, што дэлецыя NAT1 інгібіруе комплекс піруватдэгідрагеназы, што прыводзіць да мітахондрыяльнай дысфункцыі (Wang L. et al., 2019). Акрамя таго, розныя іншыя даследаванні паказалі, што інгібіраванне NAT1 з дапамогай малых малекул і глушэння siRNA можа знізіць інвазіўнасць і праліферацыю клетак рака малочнай залозы (Stepp et al., 2018). Нядаўна CRISPR/Cas9 быў выкарыстаны для падаўлення NAT1 у лініі клетак рака малочнай залозы MDA-MB-231, уплываючы на ​​клеткавы метабалізм у залежнасці ад узроўню яго экспрэсіі. Гэта даследаванне таксама паказала, што NAT-1 мае вырашальнае значэнне для прагрэсавання і метастазіравання TNBC (Carlisle et al., 2020).
Каардынаваная транскрыпцыя анкагенаў рэгулюецца суперэнхансерамі, транскрыпцыйнымі фактарамі і кофактарамі (Hnisz et al., 2015). Акрамя таго, для рэгуляцыі транскрыпцыі неабходная група цыклін-залежных кіназ (CDK), такіх як CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 і CDK13. Сярод іх CDK7 удзельнічае ў фасфараляванні РНК-палімеразы II, што вельмі важна для ініцыяцыі і пашырэння транскрыпцыі анкагенаў у патагенезе TNBC. У адным з фундаментальных даследаванняў дэлецыя CDK7 з дапамогай CRISPR/Cas9 інгібіравала TNBC, што сведчыць аб тым, што патагенез TNBC залежыць ад CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Даследаванні паказалі, што мутацыі ў MYC і RBP (RNA-звязальны бялок) могуць прывесці да апоптозу, у той час як асобныя генныя мутацыі ў MYC або RBP не ўплываюць на рост ракавых клетак (Einstein et al., 2021). Больш за 1000 RBP у геноме чалавека былі правераны з выкарыстаннем бібліятэкі на аснове CRISPR/Cas9. Сярод іх 57 RBP аказаліся крытычна важнымі для росту ракавых клетак з высока падвышаным узроўнем MYC (Wheeler et al., 2020). Акрамя таго, YTHDF2 важны для падтрымання росту клетак TNBC і зніжае колькасць метыляваных транскрыптаў падчас транскрыпцыі і трансляцыі на высокім узроўні ў ракавых клетках з больш высокай экспрэсіяй MYC. Акрамя таго, YTHDF2 не з'яўляецца неабходным для ракавых клетак, якія менш залежаць ад падвышанага ўзроўню MYC для падаўжэння выжывальнасці пацыентаў з TNBC (Einstein et al., 2021), што сведчыць аб тым, што ён можа быць патэнцыйнай тэрапеўтычнай мішэнню для лекаў, якія могуць пераадолець TNBC.
Цынкавыя пальцы (ZNF) складаюць прыблізна 1% ад агульнага геному чалавека. Даследаванні паказалі, што ZNF можа рэгуляваць праліферацыю клетак пры розных відах раку, такіх як рак печані, рак малочнай залозы і каларэктальны рак (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Бібліятэкі, створаныя шляхам накаўту CRISPR, выкарыстоўваліся для скрынінгу розных генаў-супрэсараў пухлін (TSG) у клетках рака малочнай залозы (Shalem et al., 2014). З таго часу транскрыптомнае даследаванне клетак рака малочнай залозы з дэлетаваным ZNF319 у CRISPR/Cas9 паказала, што ZNF319 з'яўляецца генам-супрэсарам пухлін, які зніжае праліферацыю рака малочнай залозы і, такім чынам, удзельнічае ў розных патэнцыйных сігнальных механізмах і іншых біялагічных функцыях (Wang L. et al., 2022).
Фераптоз — гэта тып запраграмаванай гібелі клетак, які залежыць ад прысутнасці жалеза. Вядома, што на развіццё фераптозу ўплывае прысутнасць пераксідаў ліпідаў. Акрамя таго, паведамлялася, што PKCβII праяўляе раннюю перакісную акісленне ліпідаў, і павышаная перакісная акісленне ліпідаў звязана з фераптозам. Скрынінг бібліятэкі інгібітараў кіназ, апасродкаваных CRISPR/Cas9, паказаў, што PKCβII удзельнічае ў працэсе перакіснай акіслення ліпідаў, які мае вырашальнае значэнне для фераптозу ў клетках MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Такім чынам, гэта сведчыць аб тым, што накаўт PKCβII з дапамогай CRISPR/Cas9 можа быць патэнцыйнай мішэнню гена-супрэсара пухлін для лячэння захворванняў, звязаных з фераптозам (Zhang et al., 2022).
Лічыцца, што лекавая рэзістэнтнасць адказная прыкладна за 90% смерцяў сярод анкалагічных пацыентаў і з'яўляецца адной з асноўных праблем у лячэнні раку (Bukowski et al., 2020). Вынікі паказваюць, што дастатковая колькасць генаў, звязаных з вывядзеннем лекаў, рамонтам ДНК, апоптозам і рознымі сігнальнымі шляхамі клетак, асацыюецца з лекавай рэзістэнтнасцю (Haider et al., 2020). Сярод іх некалькі генаў былі мішэнню інструментаў CRISPR/Cas9 і паказалі шматабяцальныя вынікі ў зніжэнні лекавай рэзістэнтнасці і павышэнні эфектыўнасці супрацьракавай тэрапіі (Vaghari-Tabari et al., 2022). Акрамя таго, высокапрадукцыйныя бібліятэкі скрынінга накаўтаў генаў CRISPR/Cas9 былі ўцягнутыя ў мадыфікацыю функцыі патэнцыйных генаў-мішэняў лекавай рэзістэнтнасці (Shalem et al., 2015). Для ідэнтыфікацыі генаў рэзістэнтнасці да паклітакселу было выкарыстана секвенаванне РНК у спалучэнні са скрынінгам бібліятэкі sgRNA па ўсім геноме для ідэнтыфікацыі васьмі генаў-кандыдатаў, у тым ліку гістонавай дэацэтылазы 9 (HDAC9), якія асацыююцца з лекавай рэзістэнтнасцю ў пацыентаў з рэцыдывавальным TNBC (B et al., 2020). У іншым даследаванні назіралася павышаная экспрэсія дызерыну/трэаніну і тыразін-пратэінкіназы (DSTYK) падчас выжывання пацыентаў з TNBC, якія атрымлівалі супрацьракавыя прэпараты. Больш за тое, знішчэнне DSTYK, апасродкаванае CRISPR/Cas9, значна павялічыла апоптоз лекава-рэзістэнтных ракавых клетак in vitro (клеткі SUM102PT і клеткі MDA-MB-468) і ў мадэлі TNBC in vivo (Ogbu et al., 2021).
Нягледзячы на ​​тое, што пры TNBC назіраецца анамальная актывацыя шляху MAPK, клінічны эфект ад тэрапіі, накіраванай на MEK, слабы. Скрынінг геномнай бібліятэкі CRISPR/Cas9 паказаў, што інгібіраванне PSMG2 (шаперон 2 зборкі пратэому) сенсібілізуе клеткі TNBC BT549 і MB468 да інгібітара MEK AZD6244. Зніжэнне PSMG2 з дапамогай CRISPR/Cas9 змяніла нармальную функцыю пратэасомы, што прывяло да разборкі PDPK1, апасродкаванай аўтафагіяй, тым самым яшчэ больш паляпшаючы стан пухлінных клетак у мышэйных мадэлях TNBC, выкліканых AZD6244 (інгібітарам MEK) і MG132 (інгібітарам пратэасомы). Такім чынам, інгібітары пратэасомы і MAP-кіназы (MEK) можна ўжываць сінергічна для зніжэння праліферацыі пухлінных клетак (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 таксама выкарыстоўваўся для скрынінга страты функцыі генаў, што прыводзіць да рэзістэнтнасці да TNBC (Shu et al., 2020). Ge et al. растлумачылі механізм лекавай рэзістэнтнасці ракавых клетак, якія атрымлівалі JQ1, інгібітар бромадамена BET (BBDI), пры TNBC. Выкарыстоўваючы CRISPR/Cas9, яны выявілі, што выдаленне гена rb1 прывяло да таго, што TNBC стала рэзістэнтнай да супрацьракавага прэпарата JQ1. Такім чынам, функцыя rb1 важная ў рэакцыі на прэпараты JQ1 пры TNBC. Яны таксама паведамілі, што паклітаксел з'яўляецца інгібітарам кіназы/мікратрубачак CDK4/6, і яго спалучэнне з BBDI, такімі як JQ1, можа забяспечыць перспектыўныя тэрапеўтычныя адказы на лекава-рэзістэнтны TNBC (Ge et al., 2020).
Паведамлялася, што транскрыпцыйны ландшафт доўгай некадзіруючай РНК (днРНК) адказвае за рэзістэнтнасць да неаад'ювантнай тэрапіі пры TNBC. Гэта даследаванне паказвае, што пяць розных транскрыптаў днРНК MALAT1 высока экспрэсуюцца пры TNBC. Акрамя таго, дэлецыя MALAT1, апасродкаваная CRISPR/Cas9, павялічыла адчувальнасць клетак TNBC BT-549 да паклітакселу і доксарубіцыну, што сведчыць аб патэнцыйнай ролі рэзістэнтнасці да MALAT1 пры TNBC (Shaath et al., 2021).
Мутацыі ў гене BRCA1 (BRCA1m) неаднародныя і таму іх цяжка выявіць. Таргетная ўздзеянне на PARP1 (полі(АДФ-рыбоза)-палімеразу), сінтэтычны смяротны партнёр BRCA1, можа павялічыць хіміяадчувальнасць TNBC да лекаў. Пры выкарыстанні CRISPR/Cas9 дэлецыя PARP1 павялічыла адчувальнасць супрацьракавых прэпаратаў, такіх як доксарубіцын, гемцытабін і доцэтаксел, да клетак TNBC з мутацыяй mBRCA1, што сведчыць аб тым, што PARP1 таксама ўдзельнічае ў рэзістэнтнасці да лекаў пры TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Вядома, што мутацыі ў генах-супрэсарах пухлін BRCA1 або BRCA2 павялічваюць верагоднасць развіцця раку малочнай залозы ў людзей. Лячэнне гэтых пацыентаў патрабуе выкарыстання інгібітараў PARP. Акрамя таго, было паказана, што накаўт нуклеатыднага выратавальнага фактару DNPH1 з дапамогай CRISPR/Cas9 можа выдаліць таксічны нуклеатыд 5-гідраксіметылдэзоксіурыдын (hmdU) монафасфат, тым самым узмацняючы рэакцыю клетак з дэфіцытам BRCA на адчувальнасць да інгібітараў PARP (Fugger. et al., 2021). Такім чынам, інгібітары CRISPR/Cas9 і PARP1 могуць стаць важнай стратэгіяй лячэння TNBC.
Ген пенетрантнага глікапратэіна (P-gp) — гэта ген множнай лекавай устойлівасці, які звычайна знаходзіцца ў павышанай ступені прыблізна ў 41% усіх выпадкаў TNBC (Sun et al., 2020). Вывядзенне лекаў, выкліканае P-gp, было вызначана як ключавы рэгулятар лекавай устойлівасці пры раку малочнай залозы. Інгібітары P-gp прадэманстравалі павышаную адчувальнасць да супрацьракавых прэпаратаў пры раку малочнай залозы (Famta et al., 2021). Такім чынам, абляцыя або падаўленне P-gp і інгібітараў P-gp, апасродкаваныя CRISPR/Cas9, могуць быць вельмі важнымі метадамі пераадолення лекавай устойлівасці пры TNBC.
Вядома, што АТФ-звязальны касетны транспарцёр G2 (ABCG2) выклікае лекавую рэзістэнтнасць пры TNBC (Palasuberniam et al., 2015), хоць у цяперашні час няма паведамленняў пра сувязь паміж CRISPR/Cas9 і заглушэннем ABCG2 і інактывацыяй генаў-супрэсараў пухлін. PTEN можа ўзмацняць актывацыю ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Такім чынам, выкарыстанне CRISP/Ca9 для выдалення ABCG2 і спалучэнне яго з інгібітарам ABCG2 можа быць прыдатным метадам лячэння для пераадолення лекавай рэзістэнтнасці пры TNBC. У табліцы 2 згадваецца CRISPR/Cas9, накіраваны на ўсе гены рэзістэнтнасці.
Табліца 2. CRISPR/Cas9 накіраваны на розныя гены рэзістэнтнасці TNBC для павышэння адчувальнасці клетак да супрацьракавых прэпаратаў.
Бібліятэкі CRISPR/Cas9 з'яўляюцца патэнцыйнымі інструментамі для скрынінгу генных мутацый, звязаных з патагенезам раку (Chan et al., 2022). Гэты метад скрынінгу ўключае чатыры этапы, такія як (а) канструяванне бібліятэкі, (б) трансдукцыя лентывіруса, (в) фенатыпічны скрынінг і (г) аналіз генаў-мішэняў. Нягледзячы на ​​тое, што пры TNBC назіраецца анамальная актывацыя шляху MAPK, клінічны прагноз мэтавай тэрапіі MEK для пацыентаў з TNBC, якія маюць мутацыі ў генах-супрэсарах пухлін, такіх як PTEN, RB1 і TP53, вельмі дрэнны.
Акрамя таго, скрынінг накаўту генаў з выкарыстаннем CRISPR/Cas9 пратэставаў найбольш магутную і селектыўную малекулу, дэгідракотрол, які багаты на экстракт кветак і лісця Гватэмалы, каб зразумець уплыў дэгідракотролу на MDA-MB-231. Механізмы селектыўнай цытатаксічнасці клетак. Характарыстыкі мезенхімальнай ствалавасці падтыпаў TNBC. Гэты скрынінг на аснове CRISPR/Cas9 таксама паказаў, што HSD17B11, ген, які кадуе 17β-гідраксістэроіддэгідрагеназу тыпу 11, высока экспрэсуецца ў клетках MDA-MB-231 і прыводзіць да дэгідрафалькарынолу, спецыфічнага для клетак MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Такім чынам, гэта сведчыць аб тым, што геномны скрынінг CRISPR/Cas9 мае вялікі патэнцыял у выяўленні механізмаў, якія ляжаць у аснове супрацьракавых уласцівасцей патэнцыйных прыродных злучэнняў.
Акрамя таго, уразлівасць TNBC да раку была вывучана з выкарыстаннем непрадузятага полногеномного скрынінга CRISPR/Cas9 in vivo, які паказаў сувязь паміж анкагеннымі і пухліннымі супрэсарнымі шляхамі. Паведамлялася, што ключавыя кампаненты шляхоў mTOR і Hippo гуляюць важную ролю ў рэгуляцыі пухлін пры TNBC. Акрамя таго, даследаванні паказалі, што фармакалагічнае інгібіраванне анкабялкоў mTORC1/2 і YAP эфектыўна інгібіруе патагеннасць TNBC з выкарыстаннем мадэлі сінергіі прэпарат-матрыца in vitro і ксенатрансплантатаў, атрыманых ад пацыентаў in vivo. Больш за тое, інгібіраванне mTORC1/2, апасродкаванае Torin-1, павялічвае макрапінацытоз, тады як інгібіраванне YAP, выкліканае вертэпарфінам, прыводзіць да гібелі клетак TNBC. У сукупнасці гэтыя вынікі падкрэсліваюць магутнасць і надзейнасць полногеномного in vivo скрынінга CRISPR для выяўлення новых і эфектыўных метадаў лячэння TNBC (Dai et al., 2021).
Парушэнне рэгуляцыі імуннай сістэмы з'яўляецца важным фактарам у тумарыгенезе. Ракавыя клеткі пазбягаюць імуннага ачышчэння, абыходзячы ахоўныя механізмы, у тым ліку ўмешваючыся ў актыўнасць імунных клетак у мікраасяроддзі пухліны і парушаючы імунную сістэму. Такім чынам, распрацоўка палепшанай імуннай сістэмы можа быць ключавым падыходам да барацьбы з пухлінамі. Выкарыстанне геннай мадыфікацыі на аснове CRISPR/Cas9 вырашае некалькі праблем, звязаных з імуннай дысфункцыяй, з розных пунктаў гледжання. CRISPR/Cas9 выкарыстоўваўся для паляпшэння супрацьпухліннага імунітэту супраць раку малочнай залозы праз наступныя шляхі (Малюнак 3).
Малюнак 3. Імунатэрапія CRISPR/Cas9 накіравана на клеткі TNBC. Страта CDK5 і знішчэнне PDL1 і CD155 умацоўваюць імунную сістэму. Аналагічна, страта A2AR і знішчэнне TAA, такіх як HER2, муцын 1 і TEM8, павялічваюць эфектыўнасць CAR-T-клетак у знішчэнні ракавых клетак. Скрынінг T-клетак з дапамогай CRISPR/Cas9 паказаў, што парушэнне кіназы p38 павышае супрацьпухлінную актыўнасць T-клетак. T-клеткі, мадыфікаваныя CRISPR/Cas9, павялічваюць экспрэсію TCR (рэцэптара T-клетак), у выніку чаго T-клеткі маюць супрацьпухлінную актыўнасць.
Мэта імунатэрапіі — стымуляваць імунную сістэму да атакі ракавых клетак. Празмерная экспрэсія імунных кантрольных бялкоў звычайна прадухіляе аўтаімунные рэакцыі, але можа дапамагчы ракавым захворванням пазбегнуць іх (Topalian et al., 2015). Гэтыя бялкі прадухіляюць імунныя рэакцыі, звязваючыся з рэцэптарамі на паверхні імунных клетак. Множныя кантрольныя бялкі (напрыклад, CD155 і PD-L1) накіраваны на рэцэптар PD-1 на імунных клетках і экспрэсуюцца пры раку малочнай залозы, асабліва пры раку TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Зніжэнне экспрэсіі PD-L1 або яго рэцэптара з дапамогай CRISPR/Cas9 можа стымуляваць імунную сістэму да атакі пухлін TNBC (Yahata et al., 2019). Акрамя таго, было паказана, што паніжэнне экспрэсіі PD-L1 праз CRISPR/Cas9-апасродкаваную дэлецыю CDK5 інгібіруе рост пухліны in vitro і in vivo (Deng et al., 2020). Інгібіраванне росту ў мадэлях раку малочнай залозы in vitro і in vivo сведчыць аб тым, што зніжэнне ўзроўню CD155, апасродкаванае shRNA, можа мець тэрапеўтычны эфект пры раку малочнай залозы (Gao et al., 2018).
CAR-Т-клеткі экспрэсуюць CAR, якія распазнаюць пухлінна-асацыяваныя антыгены (TAA) і могуць выкарыстоўваць паніжэнне кантрольных бялкоў для павышэння сваёй актыўнасці (Li C. et al., 2020). Існуюць розныя патэнцыйныя мішэні для CAR-Т-клетачнай тэрапіі пры раку малочнай залозы, у тым ліку некалькі TAA, такіх як HER2, mucin1 і TEM8 (Bajgain et al., 2018). Ёсць доказы таго, што CAR-Т-клеткі, накіраваныя на мезатэлін (звышэкспрэсаваны ў клетках TNBC BT-459), больш эфектыўныя супраць раку, калі PD-1 выключаецца з дапамогай CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Аднак вылучэнне Т-клетак ад пацыентаў і наступнае іх рэдагаванне ex vivo - гэта працаёмкі і працяглы працэс. Нягледзячы на ​​тое, што універсальныя Т-клеткі могуць знізіць патрабаванні да вылучэння, донарскія Т-клеткі, якія экспрэсуюць чалавечы лейкацытарны антыген (HLA) класа I і Т-клетачны рэцэптар (TCR), павінны быць выдалены, каб прадухіліць анамаліі рэакцыі "трансплантат супраць гаспадара" (Ren et al., 2017, 2017a). Выкарыстоўваючы CRISPR/Cas9, HDR можа адначасова ліквідаваць TCR і HLA і накаўтаваць ген, які кадуе CAR. Даследаванні паказалі, што CRISPR/Cas9 можа быць выкарыстаны для ўвядзення антыцелаў CAR супраць CD19 у локус TCR, тым самым эфектыўна вырабляючы CAR без знясілення Т-клетак (Dimitri et al., 2022). Былі распрацаваны мультыплексныя тэхналогіі для стварэння алогенных CAR Т-клетак шляхам адначасовага ліквідацыі TCR, бэта-2-мікраглабуліну (B2M), субадзінкі HLA-I і іншых бялкоў, такіх як PD-1 і CTLA-4, якія могуць мець больш моцныя супрацьракавыя ўласцівасці супраць TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Выкарыстанне CRISPR/Cas9 можа палепшыць эфектыўнасць CAR-T-клетак. Вядома, што адэназін валодае імунасупрэсіўнымі ўласцівасцямі і можа зніжаць супрацьракавы імунітэт, блакуючы функцыю Т-клетак і актывуючы адэназінавыя рэцэптары A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Прыглушэнне A2AR з дапамогай CRISPR/Cas9 значна палепшыла эфектыўнасць CAR-T-клетак in vivo (Giuffrida et al., 2021). Вядома, што Т-клеткі праяўляюць розныя фенатыпічныя характарыстыкі, такія як клетачная экспансія, дыферэнцыяцыя, акісляльны стрэс і геномны стрэс. Скрынінг Т-клетак на аснове CRISPR/Cas9 выявіў парушэнне 25 розных кіназ рэцэптараў Т-клетак. Сярод іх было паказана, што дэлецыя кіназы p38 павышае супрацьпухлінную актыўнасць Т-клетак, што сведчыць аб тым, што кіназа p38 з'яўляецца ключавым рэгулятарам рэгуляцыі CAR-T-клетак (Gurusamy et al., 2020).
Т-клеткі можна генетычна мадыфікаваць з дапамогай CRISPR/Cas9 для атрымання высокаэкспрэсаваных Т-клетак. Перанос генетычна мадыфікаваных Т-клетак пацыентам прадэманстраваў больш моцную супрацьракавую актыўнасць, чым эндагенныя Т-клеткі. Такім чынам, эндагенныя Т-клеткі могуць канкураваць з генетычна змененымі Т-клеткамі ў пацыентаў, што можа паўплываць на патэнцыял імунатэрапіі раку. Каб пераадолець гэтую праблему, выкарыстанне CRISPR/Cas9 для выдалення эндагеннага TCR-β у клетках-рэцыпіентах і наступнага пераносу Т-клетак TCR-β пацыентам з ракам можа праяўляць лепшыя супрацьракавыя імунныя рэакцыі без неабходнасці эндагеннай сэксуальнай канкурэнцыі Т-клетак (Fan et al. 2018). Такім чынам, за выключэннем CRISPR-мадыфікаваных Т-клетак, Т-клеткі ў тысячу разоў больш адчувальныя да пухлінных антыгенаў, чым нармальныя Т-клеткі, трансдукаваныя Т-клеткай. Акрамя таго, пры розных лейкеміях змененыя Т-клеткі, якія генеруюцца γδ TCR+ CRISPR, праяўляюць больш высокую экспрэсію CD4+ і CD8+ Т-клетак, чым стандартны перанос Т-клетак (Legut et al., 2018). Такім чынам, мадыфікаваныя Т-клеткі, атрыманыя з дапамогай CRISPR/Cas9, могуць быць эфектыўным метадам імунатэрапіі для пераадолення TNBC.
Інтэгрыны — гэта малекулы клетачнай адгезіі, якія прысутнічаюць у клеткавых трансмембранах і спрыяюць звязванню клетак з пазаклеткавым матрыксам (ECM) (Hamidi and Ivaska, 2018). Парушэнне рэгуляцыі інтэгрынаў звязана з развіццём і міграцыяй раку шляхам змены пазаклеткавага матрыкса, што прыводзіць да выжывання ракавых клетак у кровазвароте (Hamidi and Ivaska, 2018). Зніжэнне ўзроўню інтэгрынаў, апасродкаванае CRISPR/Cas9, запавольвае прагрэсаванне пухліны, метастазаванне і каланізацыю пры TNBC. Паведамлялася, што знішчэнне ўзроўню інтэгрыну a5 (ITGA5) зніжае міграцыю і прагрэсаванне клетак пры іншых відах раку, такіх як рак лёгкіх (Ju et al., 2017), што сведчыць аб тым, што інтэгрын a5 таксама можа быць ключавым фактарам у патагенезе TNBC.
Стварэнне накаўтных мышэй з выкарыстаннем традыцыйных метадаў эмбрыянальных ствалавых (ЭС) клетак — гэта працаёмкі, працяглы і неэфектыўны працэс. Патрабуюцца месяцы і гады, каб нацэліцца на ЭС клеткі шляхам гамалагічнай рэкамбінацыі, развесці хімерных мышэй, а затым скрыжаваць іх з гетэразіготнымі мышамі для атрымання гамазіготнага нашчадства. Для стварэння мышэй з некалькімі генетычнымі мутацыямі патрабуецца складанае скрыжаванне. Аднак пры выкарыстанні мышэй, атрыманых шляхам абляцыі ЭС клетак з выкарыстаннем CRISPR/Cas9 або шляхам мікраін'екцыі кампанентаў CRISPR/Cas9 у аплодненыя аднаклетачныя яйкаклеткі, узнікла шмат праблем. Напрыклад, увядзенне змяненняў часта адбываецца ў біалельных локусах і не з'яўляецца ген-спецыфічным. Нядаўна паведамлялася, што ЭС клеткі з выкарыстаннем тэхналогіі CRISPR/Cas9 могуць адначасова ўстаўляць біалельныя мутацыі ў 5 генаў (Nishizono et al., 2021). Для гэтай мэты мРНК Cas9 і пяць ген-спецыфічных гРНК былі адначасова трансфектаваны ў ЭС клеткі. Гэта падкрэслівае перспектыўнасць і эфектыўнасць гэтай працэдуры, хоць гэтыя мутацыі маглі быць перададзеныя пры скрыжаванні ліній-заснавальнікаў для атрымання пяціразовых накаўтных мышэй. У даследаванні таксама паведамляецца пра нечаканае адкрыццё: для стварэння генетычна мадыфікаваных мышэй больш не патрэбныя эмбрыянальныя ствалавыя клеткі. Замест гэтага, каб выдаліць спецыфічныя прадукты генаў, у эмбрыёны на стадыі аднаклетачнай стадыі былі ўведзены мРНК і гРНК Cas9. У выніку былі створаны накаўтныя лініі-заснавальнікі, якія тэарэтычна можна выкарыстоўваць для вывучэння наступстваў дэлецыі генаў у мышэй (Qin et al., 2016). Такім чынам, CRISPR/Cas9 дазваляе ствараць трансгенных мышэй для лячэння TNBC з больш нізкімі выдаткамі, чым традыцыйная генная інжынерыя. З дапамогай сістэмы CRISPR/Cas была распрацавана новая мадэль накаўтных мышэй, якая можа паспяхова ўводзіць кропкавыя мутацыі ў адзін або некалькі эндагенных генаў пры TNBC. Зыходзячы з гэтай канцэпцыі, жывёльныя мадэлі TNBC таксама можна распрацаваць з выкарыстаннем CRISPR/Cas9-апасродкаванай дэлецыі BRCA1 і p53, што прыводзіць да страты рэпарацыі HR, геномнай нестабільнасці і мутантных фенатыпаў (Annunziato et al., 2020).
У цяперашні час для дыягностыкі TNBC выкарыстоўваюцца розныя метады, такія як мамаграфія, магнітна-рэзанансная тамаграфія (МРТ) і ультрагукавое даследаванне. Аднак гэтыя метады маюць некаторыя абмежаванні. Мамаграфія выкарыстоўваецца для дыягностыкі лакальнай тканіны малочнай залозы, а не метастазаў, калі ракавыя клеткі мігравалі ў іншыя органы. Ультрагукавое даследаванне не з'яўляецца надзейным метадам дыягностыкі TNBC (Chen and Lee-Felker, 2023). МРТ мае больш высокую адчувальнасць, чым ультрагукавое даследаванне і мамаграфія, але яе дыягнастычная дакладнасць абмежаваная (Sha and Chen, 2022). Біяпсія тканіны - гэта інвазівны спосаб выяўлення ракавых клетак. Аднак у некаторых выпадках біяпсія можа прапусціць ракавую тканіну, калі іголка адхіляецца ад вобласці цікавасці. Акрамя таго, гэта вельмі дарагі і можа быць траўматычным для пацыента. TNBC - гэта гетэрагенны тып раку, таму біяпсія можа не даць дастаткова інфармацыі аб тыпе раку. Такім чынам, тэрмінова неабходны новы дыягнастычна надзейны метад выяўлення TNBC. CRISPR/Cas9 можа служыць высокаадчувальнай і мінімальна інвазівнай альтэрнатывай для дыягностыкі рака малочнай залозы. З гэтай мэтай стратэгіі на аснове CRISPR/Cas9 могуць быць выкарыстаны для паляпшэння метадаў ПЛР для дыягностыкі TNBC. Спачатку бялкі Cas9 і cpf1 сістэмы CRISPR выкарыстоўваюцца для выдалення неспецыфічнай ДНК, а затым гэтыя два бялкі (Cas9 і cpf1) могуць распазнаваць паслядоўнасць PAM перад звязваннем з мэтавай ДНК (Deepak Singh et al., 2021). Такім чынам, ПЛР можа ідэнтыфікаваць мутацыі, звязаныя з развіццём раку. Некалькі даследаванняў прынялі гэтую стратэгію на аснове CRISPR для выяўлення розных мутацый у розных відах раку (Safari et al., 2019). Такім чынам, метады ПЛР на аснове CRISPR могуць знізіць залежнасць дыягностыкі TNBC ад інвазівных метадаў, такіх як імунагістахімія на аснове біяпсіі.
Генатыпічныя змены ў рэгуляцыі гармональных рэцэптараў таксама былі прадэманстраваны пры TNBC (Chen and Russo, 2009). Стратэгіі ПЦР на аснове CRISPR/Cas9 з выкарыстаннем мікрачыпаў для дыягностыкі ў месцы аказання медыцынскай дапамогі могуць эфектыўна кантраляваць гэтыя мутацыі (Hajian et al., 2019). Гэта таксама можа даць медыцынскім работнікам адпаведную інфармацыю аб канкрэтных мутацыях у пацыентаў з TNBC, што можа дапамагчы палепшыць курс іх лячэння. Аднак гэты камбінаваны метад мае абмежаванні. Такім чынам, неабходныя шырокія даследчыя намаганні, перш чым гэты метад CRISPR/Cas-PCR можна будзе выкарыстоўваць у ахове здароўя для дыягностыкі TNBC (Yang et al., 2019).