Дыферэнцыяльная дыягностыка лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай камп'ютэрнай тамаграфіі (КТ), застаецца праблемай у клінічнай практыцы. Тут мы характарызуем глабальны метабалом 480 узораў сыроваткі крыві, уключаючы здаровых кантрольных груп, дабраякасныя вузельчыкі лёгкіх і аденокарцыному лёгкіх I стадыі. Аденокарцыномы дэманструюць унікальныя метабаломныя профілі, у той час як дабраякасныя вузельчыкі і здаровыя асобы маюць высокае падабенства ў метабаломных профілях. У групе выяўлення (n = 306) быў ідэнтыфікаваны набор з 27 метабалітаў для дыферэнцыяцыі дабраякасных і злаякасных вузельчыкаў. AUC дыскрымінацыйнай мадэлі ў групах унутранай валідацыі (n = 104) і знешняй валідацыі (n = 111) склаў 0,915 і 0,945 адпаведна. Аналіз шляхоў выявіў павелічэнне глікалітычных метабалітаў, звязаных са зніжэннем трыптафану ў сыроватцы крыві аденокарцыномы лёгкіх у параўнанні з дабраякаснымі вузельчыкамі і здаровымі кантрольнымі групамі, і выказаў здагадку, што паглынанне трыптафану спрыяе гліколізу ў клетках рака лёгкіх. Наша даследаванне падкрэслівае каштоўнасць біямаркераў сыроватачных метабалітаў пры ацэнцы рызыкі лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай КТ.
Ранняя дыягностыка мае вырашальнае значэнне для павышэння выжывальнасці анкалагічных пацыентаў. Вынікі Нацыянальнага даследавання скрынінга рака лёгкіх ЗША (NLST) і Еўрапейскага даследавання NELSON паказалі, што скрынінг з дапамогай нізкадознай камп'ютэрнай тамаграфіі (LDCT) можа значна знізіць смяротнасць ад раку лёгкіх у групах высокай рызыкі1,2,3. З моманту шырокага выкарыстання LDCT для скрынінга рака лёгкіх частата выпадковых рэнтгеналагічных выяўленняў асімптаматычных лёгачных вузельчыкаў працягвае расці4. Лёгачныя вузельчыкі вызначаюцца як факальныя памутненні дыяметрам да 3 см5. Мы сутыкаемся з цяжкасцямі ў ацэнцы верагоднасці злаякаснасці і ў працы з вялікай колькасцю лёгачных вузельчыкаў, выпадкова выяўленых пры LDCT. Абмежаванні КТ могуць прывесці да частых наступных абследаванняў і ілжывастаноўчых вынікаў, што прыводзіць да непатрэбнага ўмяшання і празмернага лячэння6. Такім чынам, існуе неабходнасць распрацоўкі надзейных і карысных біямаркераў для правільнай ідэнтыфікацыі раку лёгкіх на ранніх стадыях і дыферэнцыяцыі большасці дабраякасных вузельчыкаў пры першапачатковым выяўленні7.
Комплексны малекулярны аналіз крыві (сыроватка, плазма, монануклеарныя клеткі перыферычнай крыві), уключаючы геноміку, пратэёміку або метыляванне ДНК8,9,10, прывёў да ўзрастаючай цікавасці да адкрыцця дыягнастычных біямаркераў раку лёгкіх. Тым часам метабаломічныя падыходы вымяраюць канчатковыя прадукты клетак, на якія ўплываюць эндагенныя і экзагенныя дзеянні, і таму выкарыстоўваюцца для прагназавання пачатку і зыходу захворвання. Вадкасная храматаграфія-тандемная мас-спектрометрыя (LC-MS) з'яўляецца шырока выкарыстоўваным метадам метабаломных даследаванняў дзякуючы сваёй высокай адчувальнасці і вялікаму дынамічнаму дыяпазону, які можа ахопліваць метабаліты з рознымі фізіка-хімічнымі ўласцівасцямі11,12,13. Нягледзячы на тое, што глабальны метабаломны аналіз плазмы/сыроваткі выкарыстоўваўся для ідэнтыфікацыі біямаркераў, звязаных з дыягностыкай рака лёгкіх14,15,16,17 і эфектыўнасцю лячэння18, класіфікатары сыроватачных метабалітаў для адрознення дабраякасных і злаякасных вузельчыкаў лёгкіх яшчэ патрабуюць значнага вывучэння. -маштабныя даследаванні.
Адэнакарцынома і плоскоклетачная карцынома — два асноўныя падтыпы немелкоклетачнага рака лёгкіх (НМРЛ). Розныя скрынінгавыя тэсты на камп'ютэрнай тамаграфіі (КТ) паказваюць, што адэнакарцынома з'яўляецца найбольш распаўсюджаным гісталагічным тыпам рака лёгкіх1,19,20,21. У гэтым даследаванні мы выкарысталі ультраэфектыўную вадкасную храматаграфію з мас-спектрометрыяй высокага разрознення (UPLC-HRMS) для правядзення метабаламічнага аналізу ў агульнай складанасці 695 узораў сыроваткі крыві, уключаючы здаровых кантрольных груп, дабраякасныя лёгачныя вузельчыкі і выяўленыя на КТ памерам ≤3 см. Скрынінг на адэнакарцыному лёгкіх I стадыі. Мы вызначылі панэль сыроватачных метабалітаў, якія адрозніваюць адэнакарцыному лёгкіх ад дабраякасных вузельчыкаў і здаровых кантрольных груп. Аналіз узбагачэння шляхоў паказаў, што парушэнне метабалізму трыптафану і глюкозы з'яўляюцца распаўсюджанымі зменамі пры адэнакарцыноме лёгкіх у параўнанні з дабраякаснымі вузельчыкамі і здаровымі кантрольнымі групамі. Нарэшце, мы стварылі і праверылі сыроватачны метабалічны класіфікатар з высокай спецыфічнасцю і адчувальнасцю для адрознення злаякасных і дабраякасных лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай КТ, што можа дапамагчы ў ранняй дыферэнцыяльнай дыягностыцы і ацэнцы рызыкі.
У дадзеным даследаванні ўзоры сыроваткі крыві, падабраныя па полу і ўзросце, былі рэтраспектыўна сабраны ў 174 здаровых кантрольных асоб, 292 пацыентаў з дабраякаснымі вузельчыкамі лёгкіх і 229 пацыентаў з аденокарцыномай лёгкіх I стадыі. Дэмаграфічныя характарыстыкі 695 суб'ектаў паказаны ў дадатковай табліцы 1.
Як паказана на малюнку 1a, у анкалагічным цэнтры Універсітэта Сунь Ятсена было сабрана ў агульнай складанасці 480 узораў сыроваткі крыві, у тым ліку 174 узоры ад здаровых кантрольных груп (HC), 170 дабраякасных вузельчыкаў (BN) і 136 узораў аденокарцыномы лёгкіх (LA) I стадыі. Кагорта выяўлення для немэтавага метабаламічнага прафілявання з выкарыстаннем ультраэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі з высокім разрозненнем мас-спектрометрыі (UPLC-HRMS). Як паказана на дадатковым малюнку 1, для стварэння класіфікацыйнай мадэлі і далейшага вывучэння аналізу дыферэнцыяльных шляхоў былі выяўлены дыферэнцыяльныя метабаліты паміж LA і HC, LA і BN. 104 узоры, сабраныя анкалагічным цэнтрам Універсітэта Сунь Ятсена, і 111 узораў, сабраных двума іншымі бальніцамі, былі падвергнуты ўнутранай і знешняй валідацыі адпаведна.
a Даследчая папуляцыя ў кагорце адкрыцця, якая прайшла глабальны аналіз метабаломікі сыроваткі з выкарыстаннем ультраэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі з высокім разрозненнем мас-спектрометрыі (UPLC-HRMS). b Дыскрымінантны аналіз метадам частковых найменшых квадратаў (PLS-DA) агульнага метабалома 480 узораў сыроваткі з кагорты даследавання, уключаючы здаровых кантрольных груп (HC, n = 174), дабраякасныя вузельчыкі (BN, n = 170) і аденокарцыному лёгкіх I стадыі (Лос-Анджэлес, n = 136). +ESI, рэжым станоўчай іанізацыі электрараспыленнем, -ESI, рэжым адмоўнай іанізацыі электрараспыленнем. c–e Метабаліты са значна рознай колькасцю ў дзвюх зададзеных групах (двухбаковы крытэрый знакавых рангаў Уілкоксана, скарэкціраванае па частаце ілжывых выяўленняў значэнне p, FDR <0,05) паказаны чырвоным (кратнае змяненне > 1,2) і сінім (кратнае змяненне < 0,83). ) паказаны на графіцы вулкана. f Іерархічная цеплавая карта кластэрызацыі, якая паказвае значныя адрозненні ў колькасці анатаваных метабалітаў паміж LA і BN. Зыходныя дадзеныя падаюцца ў выглядзе файлаў зыходных дадзеных.
Агульны сыроватачны метабалом 174 HC, 170 BN і 136 LA ў групе адкрыцця быў прааналізаваны з дапамогай аналізу UPLC-HRMS. Спачатку мы паказваем, што ўзоры кантролю якасці (QC) шчыльна кластарызуюцца ў цэнтры мадэлі аналізу галоўных кампанент (PCA) без нагляду, што пацвярджае стабільнасць вынікаў бягучага даследавання (Дадатковы малюнак 2).
Як паказана ў дыскрымінантным аналізе частковых найменшых квадратаў (PLS-DA) на малюнку 1b, мы выявілі відавочныя адрозненні паміж LA і BN, LA і HC у станоўчым (+ESI) і адмоўным (−ESI) рэжымах электрараспыляльнай іанізацыі. Аднак істотных адрозненняў паміж BN і HC ва ўмовах +ESI і -ESI не было выяўлена.
Мы выявілі 382 дыферэнцыяльныя прыкметы паміж LA і HC, 231 дыферэнцыяльную прыкмету паміж LA і BN і 95 дыферэнцыяльных прыкмет паміж BN і HC (крытэрый знакавых рангаў Уілксана, FDR <0,05 і множныя змены >1,2 або <0,83) (малюнак .1c-e). Пікі былі дадаткова анатаваны (дадатковыя дадзеныя 3) у параўнанні з базай дадзеных (бібліятэка mzCloud/HMDB/Chemspider) па значэнні m/z, часу ўтрымання і пошуку па мас-спектры фрагментацыі (падрабязнасці апісаны ў раздзеле "Метады")22. Нарэшце, былі выяўлены 33 і 38 анатаваных метабалітаў са значнымі адрозненнямі ў колькасці для LA ў параўнанні з BN (малюнак 1f і дадатковая табліца 2) і LA ў параўнанні з HC (дадатковы малюнак 3 і дадатковая табліца 2) адпаведна. Наадварот, у BN і HC былі выяўлены толькі 3 метабаліты са значнымі адрозненнямі ў колькасці (дадатковая табліца 2), што адпавядае перакрыццю паміж BN і HC у PLS-DA. Гэтыя розныя метабаліты ахопліваюць шырокі спектр біяхімічных рэчываў (Дадатковы малюнак 4). У сукупнасці гэтыя вынікі дэманструюць значныя змены ў сыроватачным метабаломе, якія адлюстроўваюць злаякасную трансфармацыю рака лёгкіх на ранняй стадыі ў параўнанні з дабраякаснымі вузельчыкамі лёгкіх або здаровымі людзьмі. Тым часам падабенства сыроватачнага метабалома BN і HC сведчыць аб тым, што дабраякасныя лёгачныя вузельчыкі могуць мець шмат агульных біялагічных характарыстык са здаровымі людзьмі. Улічваючы, што мутацыі гена рэцэптара эпідэрмальнага фактару росту (EGFR) распаўсюджаныя пры адэнакарцыноме лёгкіх падтыпу 23, мы імкнуліся вызначыць уплыў драйверных мутацый на сыроватачны метабалом. Затым мы прааналізавалі агульны метабаломны профіль 72 выпадкаў са статусам EGFR у групе адэнакарцыномы лёгкіх. Цікава, што мы выявілі параўнальныя профілі паміж пацыентамі з мутацыяй EGFR (n = 41) і пацыентамі з дзікім тыпам EGFR (n = 31) пры аналізе PCA (Дадатковы малюнак 5a). Аднак мы вызначылі 7 метабалітаў, колькасць якіх значна змянілася ў пацыентаў з мутацыяй EGFR у параўнанні з пацыентамі з EGFR дзікага тыпу (t-тэст, p < 0,05 і кратнасць змены > 1,2 або < 0,83) (Дадатковы малюнак 5b). Большасць гэтых метабалітаў (5 з 7) з'яўляюцца ацылкарніцінамі, якія адыгрываюць важную ролю ў шляхах акіслення тоўстых кіслот.
Як паказана ў працоўным працэсе, паказаным на малюнку 2a, біямаркеры для класіфікацыі вузельчыкаў былі атрыманы з выкарыстаннем аператараў найменшага абсалютнага скарачэння і адбору на аснове 33 дыферэнцыяльных метабалітаў, выяўленых у LA (n = 136) і BN (n = 170). Найлепшае спалучэнне зменных (LASSO) - бінарная лагістычная рэгрэсійная мадэль. Для праверкі надзейнасці мадэлі выкарыстоўвалася дзесяцікратная перакрыжаваная праверка. Адбор зменных і рэгулярызацыя параметраў карэктуюцца штрафам за максімізацыю праўдападобнасці з параметрам λ24. Глабальны метабаломны аналіз быў дадаткова праведзены незалежна ў групах унутранай валідацыі (n = 104) і знешняй валідацыі (n = 111) для праверкі эфектыўнасці класіфікацыі дыскрымінантнай мадэлі. У выніку 27 метабалітаў у наборы выяўлення былі вызначаны як найлепшая дыскрымінантная мадэль з найбольшым сярэднім значэннем AUC (мал. 2b), сярод якіх 9 мелі павышаную актыўнасць, а 18 - зніжаную актыўнасць у LA ў параўнанні з BN (мал. 2c).
Працоўны працэс для стварэння класіфікатара лёгачных вузельчыкаў, у тым ліку выбар найлепшай панэлі сыроватачных метабалітаў у наборы выяўлення з выкарыстаннем бінарнай лагістычнай рэгрэсійнай мадэлі шляхам дзесяцікратнай перакрыжаванай праверкі і ацэнкі прагнастычнай эфектыўнасці ва ўнутраных і знешніх наборах праверкі. b Статыстыка перакрыжаванай праверкі рэгрэсійнай мадэлі LASSO для выбару метабалічных біямаркераў. Прыведзеныя вышэй лічбы ўяўляюць сабой сярэднюю колькасць біямаркераў, выбраных пры зададзеным λ. Чырвоная пункцірная лінія прадстаўляе сярэдняе значэнне AUC пры адпаведнай лямбда. Шэрыя палоскі памылак прадстаўляюць мінімальныя і максімальныя значэнні AUC. Пункцірная лінія паказвае найлепшую мадэль з 27 выбранымі біямаркерамі. AUC, плошча пад крывой ROC (рэцэптарнай аперацыйнай характарыстыкі). c Змены ў кратнасці 27 выбраных метабалітаў у групе LA у параўнанні з групай BN у групе выяўлення. Чырвоны слупок - актывацыя. Сіні слупок - зніжэнне. d–f Крывыя ROC (рэцэптарнай аперацыйнай характарыстыкі), якія паказваюць магутнасць дыскрымінацыйнай мадэлі на аснове 27 камбінацый метабалітаў у наборах выяўлення, унутранай і знешняй праверкі. Зыходныя дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе файлаў зыходных дадзеных.
На аснове каэфіцыентаў вагавай рэгрэсіі гэтых 27 метабалітаў была створана прагнастычная мадэль (Дадатковая табліца 3). ROC-аналіз, заснаваны на гэтых 27 метабалітах, даў значэнне плошчы пад крывой (AUC) 0,933, адчувальнасць групы выяўлення склала 0,868, а спецыфічнасць — 0,859 (мал. 2d). Тым часам сярод 38 анатаваных дыферэнцыяльных метабалітаў паміж LA і HC набор з 16 метабалітаў дасягнуў AUC 0,902 з адчувальнасцю 0,801 і спецыфічнасцю 0,856 пры адрозненні LA ад HC (Дадатковыя малюнкі 6a-c). Таксама параўноўваліся значэнні AUC, заснаваныя на розных парогах змены кратнасці для дыферэнцыяльных метабалітаў. Мы выявілі, што класіфікацыйная мадэль найлепш спраўляецца з адрозненнем паміж LA і BN (HC), калі ўзровень змены кратнасці быў усталяваны на 1,2 супраць 1,5 або 2,0 (Дадатковыя малюнкі 7a,b). Класіфікацыйная мадэль, заснаваная на 27 групах метабалітаў, была дадаткова праверана ва ўнутраных і знешніх кагортах. Плошча пад кривой (AUC) склала 0,915 (адчувальнасць 0,867, спецыфічнасць 0,811) для ўнутранай валідацыі і 0,945 (адчувальнасць 0,810, спецыфічнасць 0,979) для знешняй валідацыі (мал. 2e, f). Для ацэнкі міжлабараторнай эфектыўнасці 40 узораў з знешняй кагорты былі прааналізаваны ў знешняй лабараторыі, як апісана ў раздзеле "Метады". Дакладнасць класіфікацыі дасягнула AUC 0,925 (дадатковы малюнак 8). Паколькі плоскоклетачная карцынома лёгкіх (LUSC) з'яўляецца другім па распаўсюджанасці падтыпам немелкоклетачнага рака лёгкіх (NSCLC) пасля аденокарцыномы лёгкіх (LUAD), мы таксама праверылі правераную патэнцыйную карыснасць метабалічных профіляў. BN і 16 выпадкаў LUSC. Плошча пад кривой (AUC) дыскрымінацыі паміж LUSC і BN склала 0,776 (дадатковы малюнак 9), што сведчыць аб горшай здольнасці ў параўнанні з дыскрымінацыяй паміж LUAD і BN.
Даследаванні паказалі, што памер вузельчыкаў на КТ-здымках станоўча карэлюе з верагоднасцю злаякаснага новаўтварэння і застаецца асноўным фактарам, які вызначае лячэнне вузельчыкаў25,26,27. Аналіз дадзеных вялікай кагорты скрынінгавага даследавання NELSON паказаў, што рызыка злаякаснага новаўтварэння ў пацыентаў з вузламі <5 мм быў нават падобны да рызыкі ў пацыентаў без вузлоў28. Такім чынам, мінімальны памер, які патрабуе рэгулярнага КТ-маніторынгу, складае 5 мм, як рэкамендуе Брытанскае таракальнае таварыства (BTS), і 6 мм, як рэкамендуе Таварыства Флейшнера29. Аднак вузельчыкі памерам больш за 6 мм і без відавочных дабраякасных прыкмет, якія называюцца нявызначанымі лёгачнымі вузельчыкамі (НЛВ), застаюцца сур'ёзнай праблемай у ацэнцы і лячэнні ў клінічнай практыцы30,31. Далей мы вывучылі, ці ўплывае памер вузельчыкаў на метабаломныя сігнатуры, выкарыстоўваючы аб'яднаныя ўзоры з кагорт выяўлення і ўнутранай валідацыі. Засяродзіўшы ўвагу на 27 валідаваных біямаркерах, мы спачатку параўналі профілі PCA метабаломаў HC і BN менш за 6 мм. Мы выявілі, што большасць кропак дадзеных для HC і BN перакрываліся, што дэманструе падобны ўзровень метабалітаў у сыроватцы крыві ў абедзвюх групах (мал. 3a). Карты прыкмет розных дыяпазонаў памераў заставаліся захаванымі ў BN і LA (мал. 3b, c), у той час як назіралася падзеленне паміж злаякаснымі і дабраякаснымі вузельчыкамі ў дыяпазоне 6–20 мм (мал. 3d). Гэтая кагорта мела AUC 0,927, спецыфічнасць 0,868 і адчувальнасць 0,820 для прагназавання злаякаснасці вузельчыкаў памерам ад 6 да 20 мм (мал. 3e, f). Нашы вынікі паказваюць, што класіфікатар можа ўлічваць метабалічныя змены, выкліканыя ранняй злаякаснай трансфармацыяй, незалежна ад памеру вузельчыкаў.
аб'ява Параўнанне профіляў PCA паміж зададзенымі групамі на аснове метабалічнага класіфікатара з 27 метабалітаў. CC і BN < 6 мм. b BN < 6 мм супраць BN 6–20 мм. у LA 6–20 мм супраць LA 20–30 мм. g BN 6–20 мм і LA 6–20 мм. GC, n = 174; BN < 6 мм, n = 153; BN 6–20 мм, n = 91; LA 6–20 мм, n = 89; LA 20–30 мм, n = 77. e Крывая ROC (рэцэптарная аперацыйная характарыстыка), якая паказвае прадукцыйнасць дыскрымінантнай мадэлі для вузельчыкаў 6–20 мм. f Значэнні верагоднасці былі разлічаны на аснове лагістычнай рэгрэсійнай мадэлі для вузельчыкаў памерам 6–20 мм. Шэрая пункцірная лінія прадстаўляе аптымальнае значэнне парога (0,455). Прыведзеныя вышэй лічбы прадстаўляюць працэнт выпадкаў, прагназаваных для Лос-Анджэлеса. Выкарыстоўвайце двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта. PCA, аналіз галоўных кампанент. Плошча пад крывой AUC. Зыходныя дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе файлаў зыходных дадзеных.
Чатыры ўзоры (ва ўзросце 44–61 года) з падобнымі памерамі лёгачных вузельчыкаў (7–9 мм) былі дадаткова адабраны для ілюстрацыі эфектыўнасці прапанаванай мадэлі прагназавання злаякасных новаўтварэнняў (мал. 4a, b). Пры першапачатковым скрынінгу выпадак 1 праявіўся як цвёрды вузельчык з кальцыфікацыяй, што асацыюецца з дабраякаснасцю, тады як выпадак 2 праявіўся як нявызначаны часткова цвёрды вузельчык без відавочных дабраякасных прыкмет. Тры раўнды наступных камп'ютэрных тамаграфічных даследаванняў паказалі, што гэтыя выпадкі заставаліся стабільнымі на працягу 4-гадовага перыяду і таму лічыліся дабраякаснымі вузельчыкамі (мал. 4a). У параўнанні з клінічнай ацэнкай серыйных камп'ютэрных тамаграфічных даследаванняў, аднаразовы аналіз метабалітаў сыроваткі крыві з выкарыстаннем бягучай мадэлі класіфікатара хутка і правільна ідэнтыфікаваў гэтыя дабраякасныя вузельчыкі на аснове імавернасных абмежаванняў (табліца 1). На малюнку 4b у выпадку 3 паказаны вузельчык з прыкметамі плеўральнай ретракцыі, якая часцей за ўсё асацыюецца са злаякаснасцю32. Выпадак 4 праявіўся як нявызначаны часткова цвёрды вузельчык без доказаў дабраякаснай прычыны. Усе гэтыя выпадкі былі прагназаваны як злаякасныя ў адпаведнасці з мадэллю класіфікатара (табліца 1). Ацэнка аденокарцыномы лёгкіх была прадэманстравана гістапаталагічнай экспертызай пасля аперацыі па рэзекцыі лёгкіх (мал. 4b). Для знешняга валідацыйнага набору метабалічны класіфікатар дакладна прадказаў два выпадкі нявызначаных вузельчыкаў у лёгкіх памерам больш за 6 мм (дадатковы малюнак 10).
КТ-здымкі аксіяльнага акна лёгкіх двух выпадкаў дабраякасных вузельчыкаў. У выпадку 1 КТ-сканаванне праз 4 гады паказала стабільны цвёрды вузел памерам 7 мм з кальцыфікацыяй у правай ніжняй долі. У выпадку 2 КТ-сканаванне праз 5 гадоў выявіла стабільны, часткова цвёрды вузел дыяметрам 7 мм у правай верхняй долі. b. КТ-здымкі аксіяльнага акна лёгкіх і адпаведныя паталагічныя даследаванні двух выпадкаў адэнакарцыномы I стадыі да рэзекцыі лёгкіх. У выпадку 3 быў выяўлены вузел дыяметрам 8 мм у правай верхняй долі з плеўральнай рэтракцыяй. У выпадку 4 быў выяўлены часткова цвёрды вузел тыпу «матавы шкло» памерам 9 мм у левай верхняй долі. Афарбоўванне рэзекаванай лёгачнай тканіны гематаксілінам і эазінам (H&E) (маштабная шкала = 50 мкм), што дэманструе ацынарны характар росту адэнакарцыномы лёгкіх. Стрэлкі паказваюць вузельчыкі, выяўленыя на КТ-здымках. H&E-здымкі з'яўляюцца рэпрэзентатыўнымі выявамі некалькіх (>3) мікраскапічных палёў, даследаваных паталагаанатамам.
У сукупнасці нашы вынікі дэманструюць патэнцыйную каштоўнасць біямаркераў сыроватачных метабалітаў у дыферэнцыяльнай дыягностыцы лёгачных вузельчыкаў, што можа ствараць праблемы пры ацэнцы камп'ютэрнай тамаграфічнай тамаграфіі.
На падставе валідаванай дыферэнцыяльнай панэлі метабалітаў мы імкнуліся вызначыць біялагічныя карэляты асноўных метабалічных змен. Аналіз узбагачэння шляхоў KEGG, праведзены з дапамогай MetaboAnalyst, выявіў 6 агульных значна змененых шляхоў паміж двума дадзенымі групамі (LA супраць HC і LA супраць BN, скарэкціраваны p ≤ 0,001, эфект > 0,01). Гэтыя змены характарызаваліся парушэннямі метабалізму пірувату, метабалізму трыптафану, метабалізму ніацыну і нікацінаміду, гліколізу, цыклу TCA і метабалізму пурынаў (мал. 5a). Затым мы правялі мэтанакіраваную метабаломіку для праверкі асноўных змен з выкарыстаннем абсалютнай колькаснай ацэнкі. Вызначэнне агульных метабалітаў у звычайна змененых шляхах з дапамогай патройнай квадрупольнай мас-спектрометрыі (QQQ) з выкарыстаннем аўтэнтычных стандартаў метабалітаў. Дэмаграфічныя характарыстыкі мэтавай выбаркі даследавання метабаломікі ўключаны ў Дадатковую табліцу 4. У адпаведнасці з нашымі глабальнымі вынікамі метабаломікі, колькасны аналіз пацвердзіў, што ўзровень гіпаксанціну і ксантыну, пірувату і лактату быў павялічаны ў LA ў параўнанні з BN і HC (мал. 5b, c, p <0,05). Аднак істотных адрозненняў у гэтых метабалітах паміж BN і HC не выяўлена.
Аналіз узбагачэння шляху KEGG значна розных метабалітаў у групе LA у параўнанні з групамі BN і HC. Быў выкарыстаны двухбаковы глабальны тэст, і значэнні p былі скарэкціраваны з выкарыстаннем метаду Холма-Банфероні (скарэкціраваны p ≤ 0,001 і памер эфекту > 0,01). b–d Дыяграмы скрыпкі, якія паказваюць узроўні гіпаксанціну, ксантыну, лактату, пірувату і трыптафану ў сыроватцы HC, BN і LA, вызначаныя метадам LC-MS/MS (n = 70 на групу). Белыя і чорныя пункцірныя лініі паказваюць медыяну і квартыль адпаведна. e Дыяграма скрыпкі, якая паказвае нармалізаваную экспрэсію мРНК SLC7A5 і QPRT у Log2TPM (транскрыпты на мільён) у аденокарцыноме лёгкіх (n = 513) у параўнанні з нармальнай тканінай лёгкіх (n = 59) у наборы дадзеных LUAD-TCGA. Белая рамка прадстаўляе міжквартыльны дыяпазон, гарызантальная чорная лінія ў цэнтры прадстаўляе медыяну, а вертыкальная чорная лінія, якая працягваецца ад рамки, прадстаўляе 95% даверны інтэрвал (ДІ). f Графік карэляцыі Пірсана экспрэсіі SLC7A5 і GAPDH у аденокарцыноме лёгкіх (n = 513) і нармальнай тканіне лёгкіх (n = 59) у наборы дадзеных TCGA. Шэрая зона прадстаўляе 95% ДІ. r — каэфіцыент карэляцыі Пірсана. g Нармалізаваныя ўзроўні трыптафану ў клетках A549, трансфектаваных неспецыфічным кантролем shRNA (NC) і shSLC7A5 (Sh1, Sh2), вызначаныя метадам LC-MS/MS. Прадстаўлены статыстычны аналіз пяці біялагічна незалежных узораў у кожнай групе. h Клетачныя ўзроўні NADt (агульны NAD, уключаючы NAD+ і NADH) у клетках A549 (NC) і клетках A549 з паніжанай SLC7A5 (Sh1, Sh2). Прадстаўлены статыстычны аналіз трох біялагічна незалежных узораў у кожнай групе. i Глікалітычная актыўнасць клетак A549 да і пасля зніжэння экспрэсіі SLC7A5 вымяралася з дапамогай хуткасці пазаклеткавай кіслотнасці (ECAR) (n = 4 біялагічна незалежныя ўзоры на групу). 2-DG,2-дэзоксі-D-глюкоза. У (b–h) выкарыстоўваўся двухбаковы t-крытэрый Стьюдэнта. У (g–i) палоскі памылак прадстаўляюць сярэдняе значэнне ± SD, кожны эксперымент праводзіўся тры разы незалежна, і вынікі былі падобнымі. Зыходныя дадзеныя прадстаўлены ў выглядзе файлаў зыходных дадзеных.
Улічваючы значны ўплыў змененага метабалізму трыптафану ў групе LA, мы таксама ацанілі ўзровень трыптафану ў сыроватцы крыві ў групах HC, BN і LA з дапамогай QQQ. Мы выявілі, што ўзровень трыптафану ў сыроватцы крыві быў зніжаны ў LA у параўнанні з HC або BN (p < 0,001, малюнак 5d), што адпавядае папярэднім вынікам, што ўзровень трыптафану ў крыві ніжэйшы ў пацыентаў з ракам лёгкіх, чым у здаровых людзей з кантрольнай групы33,34,35. Іншае даследаванне з выкарыстаннем ПЭТ/КТ-трасера 11C-метыл-L-трыптафану паказала, што час утрымання сігналу трыптафану ў тканіны рака лёгкіх быў значна павялічаны ў параўнанні з дабраякаснымі паражэннямі або нармальнай тканінай36. Мы выказваем гіпотэзу, што зніжэнне ўзроўню трыптафану ў сыроватцы LA можа адлюстроўваць актыўнае паглынанне трыптафану клеткамі рака лёгкіх.
Таксама вядома, што канчатковым прадуктам кінурэнінавага шляху катабалізму трыптафану з'яўляецца NAD+37,38, які з'яўляецца важным субстратам для рэакцыі гліцаральдэгід-3-фасфату з 1,3-бісфосфагліцэратам у гліколізе39. Хоць папярэднія даследаванні былі сканцэнтраваны на ролі катабалізму трыптафану ў імуннай рэгуляцыі, мы імкнуліся высветліць узаемадзеянне паміж парушэннем рэгуляцыі трыптафану і глікалітычнымі шляхамі, якое назіралася ў гэтым даследаванні. Вядома, што член 5 сямейства транспарцёраў раствораных рэчываў 7 (SLC7A5) з'яўляецца транспарцёрам трыптафану43,44,45. Хіналінавая кіслата-фосфарыбазілтрансфераза (QPRT) - гэта фермент, размешчаны ніжэй па плыні ад кінурэнінавага шляху, які пераўтварае хіналінавую кіслату ў NAMN46. Аналіз набору дадзеных LUAD TCGA паказаў, што як SLC7A5, так і QPRT былі значна павышаны ў пухліннай тканіне ў параўнанні з нармальнай тканінай (мал. 5e). Гэта павелічэнне назіралася на I і II стадыях, а таксама на III і IV стадыях аденокарцыномы лёгкіх (Дадатковы малюнак 11), што сведчыць аб ранніх парушэннях метабалізму трыптафану, звязаных з тумарыгенезам.
Акрамя таго, набор дадзеных LUAD-TCGA паказаў станоўчую карэляцыю паміж экспрэсіяй мРНК SLC7A5 і GAPDH ва ўзорах пацыентаў з ракам (r = 0,45, p = 1,55E-26, малюнак 5f). У адрозненне ад гэтага, значнай карэляцыі паміж такімі геннымі сігнатурамі ў нармальнай тканіне лёгкіх не выяўлена (r = 0,25, p = 0,06, малюнак 5f). Зніжэнне экспрэсіі SLC7A5 (дадатковы малюнак 12) у клетках A549 значна знізіла ўзровень трыптафану і NAD(H) у клетках (малюнак 5g,h), што прывяло да аслаблення глікалітычнай актыўнасці, вымеранай па хуткасці пазаклеткавай кіслінкі (ECAR) (малюнак 1). 5i). Такім чынам, зыходзячы з метабалічных змен у сыроватцы крыві і выяўлення in vitro, мы выказваем гіпотэзу, што метабалізм трыптафану можа прыводзіць да ўтварэння NAD+ праз кінурэнінавы шлях і адыгрываць важную ролю ў стымуляванні гліколізу пры раку лёгкіх.
Даследаванні паказалі, што вялікая колькасць нявызначаных лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай КТ, можа прывесці да неабходнасці дадатковых аналізаў, такіх як ПЭТ-КТ, біяпсія лёгкіх і празмернае лячэнне з-за ілжыва станоўчага дыягназу злаякаснага новаўтварэння.31 Як паказана на малюнку 6, наша даследаванне вызначыла панэль сыроватачных метабалітаў з патэнцыйнай дыягнастычнай каштоўнасцю, якія могуць палепшыць стратыфікацыю рызыкі і наступнае лячэнне лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай КТ.
Лёгачныя вузельчыкі ацэньваюцца з дапамогай нізкадознай камп'ютэрнай тамаграфіі (ЛДКТ) з візуалізацыйнымі прыкметамі, якія сведчаць аб дабраякасных або злаякасных прычынах. Нявызначаны зыход пры вузельчыках можа прывесці да частых наступных візітаў, непатрэбных умяшанняў і празмернага лячэння. Уключэнне сыроватачных метабалічных класіфікатараў з дыягнастычнай каштоўнасцю можа палепшыць ацэнку рызыкі і наступнае лячэнне лёгачных вузельчыкаў. ПЭТ-пазітронна-эмісійная тамаграфія.
Дадзеныя амерыканскага даследавання NLST і еўрапейскага даследавання NELSON сведчаць аб тым, што скрынінг груп высокай рызыкі з дапамогай нізкадознай камп'ютэрнай тамаграфіі (LDCT) можа знізіць смяротнасць ад раку лёгкіх1,3. Аднак найбольш складанай застаецца ацэнка рызыкі і наступнае клінічнае лячэнне вялікай колькасці выпадкова выяўленых лёгачных вузельчыкаў з дапамогай LDCT. Галоўная мэта — аптымізаваць правільную класіфікацыю існуючых пратаколаў на аснове LDCT шляхам уключэння надзейных біямаркераў.
Пэўныя малекулярныя біямаркеры, такія як метабаліты крыві, былі выяўлены шляхам параўнання рака лёгкіх са здаровымі кантрольнымі групамі15,17. У дадзеным даследаванні мы засяродзіліся на прымяненні аналізу метабаломікі сыроваткі крыві для адрознення дабраякасных і злаякасных лёгачных вузельчыкаў, выпадкова выяўленых з дапамогай LDCT. Мы параўналі глабальны метабалом сыроваткі крыві ўзораў здаровага кантролю (HC), дабраякасных вузельчыкаў лёгкіх (BN) і аденокарцыномы лёгкіх (LA) I стадыі з выкарыстаннем аналізу UPLC-HRMS. Мы выявілі, што HC і BN мелі падобныя метабалічныя профілі, тады як LA паказала значныя змены ў параўнанні з HC і BN. Мы вызначылі два наборы метабалітаў сыроваткі крыві, якія адрозніваюць LA ад HC і BN.
Сучасная схема ідэнтыфікацыі дабраякасных і злаякасных вузельчыкаў на аснове LDCT у асноўным грунтуецца на памеры, шчыльнасці, марфалогіі і хуткасці росту вузельчыкаў з цягам часу30. Папярэднія даследаванні паказалі, што памер вузельчыкаў цесна звязаны з верагоднасцю раку лёгкіх. Нават у пацыентаў з высокай рызыкай рызыка злаякаснага новаўтварэння ў вузлах <6 мм складае <1%. Рызыка злаякаснага новаўтварэння для вузлоў памерам ад 6 да 20 мм вагаецца ад 8% да 64%30. Такім чынам, Таварыства Флейшнера рэкамендуе парогавы дыяметр 6 мм для руціннага КТ-маніторынгу.29 Аднак ацэнка рызыкі і лячэнне нявызначаных лёгачных вузельчыкаў (НЛВ) памерам больш за 6 мм не праводзіліся належным чынам31. Сучаснае лячэнне прыроджаных захворванняў сэрца звычайна заснавана на пільным чаканні з частым КТ-маніторынгам.
На падставе валідаванага метабалома мы ўпершыню прадэманстравалі перакрыццё метабаломных сігнатур паміж здаровымі асобамі і дабраякаснымі вузельчыкамі <6 мм. Біялагічнае падабенства адпавядае папярэднім вынікам КТ, якія паказалі, што рызыка злаякаснага новаўтварэння для вузельчыкаў <6 мм гэтак жа нізкі, як і для суб'ектаў без вузлоў.30 Варта адзначыць, што нашы вынікі таксама паказваюць, што дабраякасныя вузельчыкі <6 мм і ≥6 мм маюць высокае падабенства ў метабаломных профілях, што сведчыць аб тым, што функцыянальнае вызначэнне дабраякаснай этыялогіі з'яўляецца паслядоўным незалежна ад памеру вузельчыкаў. Такім чынам, сучасныя дыягнастычныя панэлі метабалітаў сыроваткі могуць забяспечыць адзін аналіз у якасці тэсту выключэння, калі вузельчыкі першапачаткова выяўляюцца на КТ, і патэнцыйна скараціць серыйны маніторынг. У той жа час тая ж панэль метабалічных біямаркераў адрознівала злаякасныя вузельчыкі памерам ≥6 мм ад дабраякасных вузельчыкаў і давала дакладныя прагнозы для міжплямавых вузельчыкаў падобнага памеру і неадназначных марфалагічных асаблівасцей на КТ-здымках. Гэты класіфікатар метабалізму сыроваткі добра спрацаваў у прагназаванні злаякаснасці вузельчыкаў ≥6 мм з AUC 0,927. У сукупнасці нашы вынікі паказваюць, што ўнікальныя метабаломныя сігнатуры сыроваткі могуць спецыфічна адлюстроўваць раннія метабалічныя змены, выкліканыя пухлінай, і мець патэнцыйную каштоўнасць у якасці прагназатараў рызыкі, незалежна ад памеру вузельчыкаў.
Варта адзначыць, што адэнакарцынома лёгкіх (LUAD) і плоскаклетачны рак (LUSC) з'яўляюцца асноўнымі тыпамі немелкоклетачнага рака лёгкіх (NSCLC). Улічваючы, што LUSC цесна звязаны з ужываннем тытуню47, а LUAD з'яўляецца найбольш распаўсюджанай гісталогіяй выпадковых вузельчыкаў лёгкіх, выяўленых пры КТ-сканіраванні48, наша мадэль класіфікатара была спецыяльна распрацавана для ўзораў адэнакарцыномы I стадыі. Ван і яго калегі таксама засяродзіліся на LUAD і вызначылі дзевяць ліпідных сігнатур з выкарыстаннем ліпідомікі для адрознення рака лёгкіх на ранняй стадыі ад здаровых асоб17. Мы пратэставалі бягучую мадэль класіфікатара на 16 выпадках LUSC I стадыі і 74 дабраякасных вузельчыках і назіралі нізкую дакладнасць прагназавання LUSC (AUC 0,776), што сведчыць аб тым, што LUAD і LUSC могуць мець свае ўласныя метабаломныя сігнатуры. Сапраўды, было паказана, што LUAD і LUSC адрозніваюцца па этыялогіі, біялагічным паходжанні і генетычных аберацыях49. Такім чынам, іншыя тыпы гісталогіі павінны быць уключаны ў навучальныя мадэлі для папуляцыйнага выяўлення рака лёгкіх у праграмах скрынінга.
Тут мы вызначылі шэсць найбольш часта змененых шляхоў пры адэнакарцыноме лёгкіх у параўнанні са здаровымі кантрольнымі групамі і дабраякаснымі вузельчыкамі. Ксанцін і гіпаксантын з'яўляюцца распаўсюджанымі метабалітамі пурынавага метабалічнага шляху. У адпаведнасці з нашымі вынікамі, прамежкавыя прадукты, звязаныя з метабалізмам пурынаў, былі значна павялічаны ў сыроватцы крыві або тканінах пацыентаў з адэнакарцыномай лёгкіх у параўнанні са здаровымі кантрольнымі групамі або пацыентамі на перадінвазіўнай стадыі15,50. Павышаны ўзровень ксантыну і гіпаксантыну ў сыроватцы крыві можа адлюстроўваць анабалізм, неабходны для хутка праліферуючых ракавых клетак. Парушэнне рэгуляцыі метабалізму глюкозы з'яўляецца добра вядомай адметнай рысай метабалізму рака51. Тут мы назіралі значнае павелічэнне пірувату і лактату ў групе LA у параўнанні з групай HC і BN, што адпавядае папярэднім паведамленням аб парушэннях глікалітычных шляхоў у профілях сыроватачнага метабалома пацыентаў з немелкоклетачным ракам лёгкіх (НМРЛ) і здаровых кантрольных груп. Вынікі адпавядаюць52,53.
Важна адзначыць, што мы назіралі адваротную карэляцыю паміж метабалізмам пірувату і трыптафану ў сыроватцы крыві пацыентаў з аденокарцыномай лёгкіх. Узровень трыптафану ў сыроватцы крыві быў зніжаны ў групе LA у параўнанні з групай HC або BN. Цікава, што папярэдняе маштабнае даследаванне з выкарыстаннем праспектыўнай кагорты паказала, што нізкі ўзровень цыркулюючага трыптафану быў звязаны з падвышанай рызыкай раку лёгкіх 54. Трыптафан - гэта незаменная амінакіслата, якую мы атрымліваем цалкам з ежы. Мы робім выснову, што знясіленне трыптафану ў сыроватцы крыві пры аденокарцыноме лёгкіх можа адлюстроўваць хуткае знясіленне гэтага метабаліту. Добра вядома, што канчатковы прадукт катабалізму трыптафану праз кінурэнінавы шлях з'яўляецца крыніцай de novo сінтэзу NAD+. Паколькі NAD+ выпрацоўваецца ў асноўным праз шлях выратавання, важнасць NAD+ у метабалізме трыптафану ў здаровым і хворым стане яшчэ трэба вызначыць 46. Наш аналіз базы дадзеных TCGA паказаў, што экспрэсія транспарцёра трыптафану растворанага рэчыва 7A5 (SLC7A5) была значна павялічана пры адэнакарцыноме лёгкіх у параўнанні з нармальнымі кантрольнымі групамі і станоўча карэлявала з экспрэсіяй глікалітычнага фермента GAPDH. Папярэднія даследаванні ў асноўным былі сканцэнтраваны на ролі катабалізму трыптафану ў падаўленні супрацьпухліннага імуннага адказу40,41,42. Тут мы паказваем, што інгібіраванне паглынання трыптафану шляхам знішчэння SLC7A5 у клетках рака лёгкіх прыводзіць да наступнага зніжэння ўзроўню NAD у клетках і адначасовага аслаблення глікалітычнай актыўнасці. Такім чынам, наша даследаванне забяспечвае біялагічную аснову для змяненняў метабалізму сыроваткі крыві, звязаных са злаякаснай трансфармацыяй адэнакарцыномы лёгкіх.
Мутацыі EGFR з'яўляюцца найбольш распаўсюджанымі драйвернымі мутацыямі ў пацыентаў з НМРЛ. У нашым даследаванні мы выявілі, што ў пацыентаў з мутацыяй EGFR (n = 41) агульныя метабаломныя профілі былі падобныя да профіляў пацыентаў з EGFR дзікага тыпу (n = 31), хоць мы выявілі зніжэнне ўзроўню EGFR у сыроватцы крыві ў некаторых пацыентаў з мутацыяй EGFR у пацыентаў з ацылкарніцінам. Устаноўленая функцыя ацылкарніцінаў заключаецца ў транспарце ацыльных груп з цытаплазмы ў мітахондрыяльную матрыкс, што прыводзіць да акіслення тоўстых кіслот для атрымання энергіі 55. У адпаведнасці з нашымі высновамі, нядаўняе даследаванне таксама выявіла падобныя профілі метабалома паміж пухлінамі з мутацыяй EGFR і дзікім тыпам EGFR шляхам аналізу глабальнага метабалома 102 узораў тканіны аденокарцыномы лёгкіх 50. Цікава, што ўтрыманне ацылкарніціну таксама было выяўлена ў групе з мутацыяй EGFR. Такім чынам, ці адлюстроўваюць змены ўзроўню ацылкарніціну выкліканыя EGFR метабалічныя змены і асноўныя малекулярныя шляхі, можа патрабаваць далейшага вывучэння.
У заключэнне, наша даследаванне ўстанаўлівае класіфікатар метабалізму сыроваткі крыві для дыферэнцыяльнай дыягностыкі лёгачных вузельчыкаў і прапануе працоўны працэс, які можа аптымізаваць ацэнку рызыкі і палегчыць клінічнае лячэнне на аснове скрынінга КТ.
Гэта даследаванне было ўхвалена Этычным камітэтам анкалагічнай бальніцы Універсітэта Сунь Ятсена, Першай філіяльнай бальніцай Універсітэта Сунь Ятсена і Этычным камітэтам анкалагічнай бальніцы Універсітэта Чжэнчжоу. У групах выяўлення і ўнутранай валідацыі было сабрана 174 сыроваткі ад здаровых асоб і 244 сыроваткі ад дабраякасных вузельчыкаў у асоб, якія праходзілі штогадовыя медыцынскія агляды ў Аддзеле кантролю і прафілактыкі рака Анкалагічнага цэнтра Універсітэта Сунь Ятсена, а таксама 166 сыроватак ад дабраякасных вузельчыкаў. Адэнакарцыномы лёгкіх I стадыі былі сабраны з Анкалагічнага цэнтра Універсітэта Сунь Ятсена. У кагорце знешняй валідацыі было 48 выпадкаў дабраякасных вузельчыкаў, 39 выпадкаў адэнакарцыномы лёгкіх I стадыі з Першай філіяльнай бальніцы Універсітэта Сунь Ятсена і 24 выпадкі адэнакарцыномы лёгкіх I стадыі з Анкалагічнай бальніцы Чжэнчжоу. Анкалагічная бальніца Універсітэта Сунь Ятсена таксама сабрала 16 выпадкаў плоскоклетачнага рака лёгкіх I стадыі для праверкі дыягнастычнай здольнасці ўстаноўленага метабалічнага класіфікатара (характарыстыкі пацыентаў паказаны ў Дадатковай табліцы 5). Узоры з кагорты выяўлення і кагорты ўнутранай валідацыі былі сабраны ў перыяд з студзеня 2018 года па май 2020 года. Узоры для кагорты знешняй валідацыі былі сабраны ў перыяд з жніўня 2021 года па кастрычнік 2022 года. Каб мінімізаваць гендэрную прадузятасць, у кожную кагорту была размеркавана прыблізна аднолькавая колькасць выпадкаў мужчынскага і жаночага полу. Каманда выяўлення і каманда ўнутранага агляду. Пол удзельнікаў вызначаўся на падставе самастойнай справаздачы. Ад усіх удзельнікаў была атрымана інфармаваная згода, і кампенсацыя не прадастаўлялася. Суб'ектамі з дабраякаснымі вузельчыкамі былі тыя, у каго быў стабільны бал КТ-сканавання праз 2-5 гадоў на момант аналізу, за выключэннем 1 выпадку з выбаркі знешняй валідацыі, які быў сабраны перад аперацыяй і дыягнаставаны гістапаталагічным даследаваннем. За выключэннем хранічнага бранхіту. Выпадкі аденокарцыномы лёгкіх былі сабраны да рэзекцыі лёгкіх і пацверджаны паталагічным дыягназам. Узоры крыві нашча збіралі ў прабіркі для падзелу сыроваткі без якіх-небудзь антыкаагулянтаў. Узоры крыві згусвалі на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы, а затым цэнтрыфугавалі пры 2851 × g на працягу 10 хвілін пры 4°C для збору сыроватачнага супернатанту. Аліквоты сыроваткі былі замарожаныя пры тэмпературы -80°C да экстракцыі метабалітаў. Аддзел прафілактыкі раку і медыцынскага абследавання Анкалагічнага цэнтра Універсітэта Сунь Ятсена сабраў пул сыроваткі ад 100 здаровых донараў, у тым ліку аднолькавую колькасць мужчын і жанчын ва ўзросце ад 40 да 55 гадоў. Роўныя аб'ёмы кожнага донарскага ўзору былі змяшаныя, атрыманы пул быў аліквотаваны і захоўваўся пры тэмпературы -80°C. Сумесь сыроваткі выкарыстоўвалася ў якасці эталоннага матэрыялу для кантролю якасці і стандартызацыі дадзеных.
Эталонную сыроватку і тэставыя ўзоры размарожвалі, а метабаліты экстрагавалі з выкарыстаннем метаду камбінаванай экстракцыі (МТБЭ/метанол/вада) 56. Карацей кажучы, 50 мкл сыроваткі змяшалі з 225 мкл ледзянога метанолу і 750 мкл ледзянога метыл-трэт-бутылавага эфіру (МТБЭ). Сумесь змяшалі і інкубавалі на лёдзе на працягу 1 гадзіны. Затым узоры змяшалі і змяшалі на віхравой мяшалцы з 188 мкл вады класа MS, якая змяшчае ўнутраныя стандарты (13C-лактат, 13C3-піруват, 13C-метыянін і 13C6-ізалейцын, набытыя ў Cambridge Isotope Laboratories). Затым сумесь цэнтрыфугавалі пры 15 000 × g на працягу 10 хвілін пры 4 °C, а ніжнюю фазу перанеслі ў дзве прабіркі (па 125 мкл кожная) для аналізу LC-MS у станоўчым і адмоўным рэжымах. Нарэшце, узор выпарвалі дасуха ў высакахуткасным вакуумным канцэнтратары.
Высушаныя метабаліты былі адноўлены ў 120 мкл 80% ацэтанітрылу, перамешаны на віхравой мікстуры на працягу 5 хвілін і цэнтрыфугаваны пры 15 000 × g на працягу 10 хвілін пры 4°C. Супернатанты былі перанесены ў бурштынавыя шкляныя флаконы з мікраўстаўкамі для метабаломных даследаванняў. Немэтавы метабаломны аналіз быў праведзены на платформе звышэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі з высокім разрозненнем (UPLC-HRMS). Метабаліты былі аддзелены з выкарыстаннем сістэмы Dionex Ultimate 3000 UPLC і калонкі ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters). У рэжыме станоўчых іёнаў рухомыя фазы складалі 95% (А) і 50% ацэтанітрылу (В), кожная з якіх утрымлівала 10 ммоль/л ацэтату амонію і 0,1% мурашынай кіслаты. У адмоўным рэжыме рухомыя фазы A і B утрымлівалі 95% і 50% ацэтанітрылу адпаведна, абедзве фазы ўтрымлівалі 10 ммоль/л ацэтату амонію, pH = 9. Градыентная праграма была наступнай: 0–0,5 хв, 2% B; 0,5–12 хв, 2–50% B; 12–14 хв, 50–98% B; 14–16 хв, 98% B; 16–16,1 хв, 98–2% B; 16,1–20 хв, 2% B. Калонка падтрымлівалася пры тэмпературы 40°C, а ўзор — пры тэмпературы 10°C у аўтасамплеры. Хуткасць патоку складала 0,3 мл/мін, аб'ём увядзення — 3 мкл. Мас-спектрометр Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) з крыніцай электрараспыляльнай іанізацыі (ESI) працаваў у рэжыме поўнага сканавання і быў звязаны з рэжымам маніторынгу ddMS2 для збору вялікіх аб'ёмаў дадзеных. Параметры мас-спектраметрыі былі ўстаноўлены наступным чынам: напружанне распылення +3,8 кВ/- 3,2 кВ, тэмпература капіляра 320°C, ахоўны газ 40 arb, дапаможны газ 10 arb, тэмпература награвальніка зонда 350°C, дыяпазон сканавання 70–1050 м/г, разрозненне 70 000. Дадзеныя былі атрыманы з дапамогай Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Для ацэнкі якасці дадзеных былі атрыманы аб'яднаныя ўзоры кантролю якасці (КК) шляхам адбору 10 мкл аліквот супернатанту з кожнага ўзору. Шэсць ін'екцый узораў кантролю якасці былі прааналізаваны ў пачатку аналітычнай паслядоўнасці для ацэнкі стабільнасці сістэмы UPLC-MS. Затым узоры кантролю якасці перыядычна ўводзяцца ў партыю. Усе 11 партый узораў сыроваткі ў гэтым даследаванні былі прааналізаваны метадам LC-MS. Аліквоты сумесі пула сыроваткі ад 100 здаровых донараў выкарыстоўваліся ў якасці эталоннага матэрыялу ў адпаведных партыях для кантролю працэсу экстракцыі і карэкціроўкі ўплыву паміж партыямі. Немэтавы метабаломны аналіз кагорты адкрыцця, кагорты ўнутранай валідацыі і кагорты знешняй валідацыі быў праведзены ў Цэнтры метабаломікі Універсітэта Сунь Ятсена. Знешняя лабараторыя Цэнтра аналізу і выпрабаванняў Тэхналагічнага ўніверсітэта Гуандуна таксама прааналізавала 40 узораў з знешняй кагорты для праверкі прадукцыйнасці мадэлі класіфікатара.
Пасля экстракцыі і аднаўлення абсалютная колькасная колькасць метабалітаў у сыроватцы крыві вымяралася з дапамогай звышвысокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі-тандемнай мас-спектрометрыі (Agilent 6495 патройны квадруполь) з крыніцай электрараспыляльнай іанізацыі (ESI) у рэжыме маніторынгу некалькіх рэакцый (MRM). Для падзелу метабалітаў выкарыстоўвалася калона ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters). Рухомая фаза складалася з 90% (А) і 5% ацэтанітрылу (В) з 10 ммоль/л ацэтату амонію і 0,1% раствора аміяку. Градыентная праграма была наступнай: 0–1,5 хв, 0% В; 1,5–6,5 хв, 0–15% В; 6,5–8 хв, 15% В; 8–8,5 хв, 15%–0% В; 8,5–11,5 хв, 0% В. Тэмпература калоны падтрымлівалася пры 40 °C, а ўзору — пры 10 °C у аўтасамплеры. Хуткасць патоку складала 0,3 мл/мін, а аб'ём увядзення — 1 мкл. Параметры мас-спектрометрыі былі ўстаноўлены наступнымі: напружанне на капіляры ±3,5 кВ, ціск у небулайзеры 35 фунтаў на квадратны дюйм, паток абалонкі 12 л/мін, тэмпература абалонкі 350 °C, тэмпература сушыльнага газу 250 °C і паток сушыльнага газу 14 л/мін. Канверсіі MRM трыптафану, пірувату, лактату, гіпаксанціну і ксантыну склалі 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 і 151,0–107,9 адпаведна. Дадзеныя былі сабраны з дапамогай Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Для ўзораў сыроваткі трыптафан, піруват, лактат, гіпаксанцін і ксанцін вызначалі колькасна з выкарыстаннем калібровачных крывых стандартных сумесевых раствораў. Для ўзораў клетак утрыманне трыптафану нармалізавалі да ўнутранага стандарту і масы клеткавага бялку.
Экстракцыя пікаў (m/z і час утрымання (RT)) праводзілася з выкарыстаннем Compound Discovery 3.1 і TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Каб ліквідаваць патэнцыйныя адрозненні паміж партыямі, кожны характэрны пік тэставага ўзору быў падзелены на характэрны пік эталоннага матэрыялу з той жа партыі для атрымання адноснай колькасці. Адносныя стандартныя адхіленні ўнутраных стандартаў да і пасля стандартызацыі паказаны ў Дадатковай табліцы 6. Адрозненні паміж дзвюма групамі характарызаваліся частатой ілжывых выяўленняў (FDR<0,05, крытэрый знакавых рангаў Уілкоксана) і зменай у кратнасці (>1,2 або <0,83). Неапрацаваныя дадзеныя MS вылучаных характарыстык і дадзеныя MS з карэкцыяй па эталоннай сыроватцы паказаны ў Дадатковых дадзеных 1 і Дадатковых дадзеных 2 адпаведна. Анатацыя пікаў праводзілася на аснове чатырох вызначаных узроўняў ідэнтыфікацыі, уключаючы ідэнтыфікаваныя метабаліты, меркавана анатаваныя злучэнні, меркавана характарызаваныя класы злучэнняў і невядомыя злучэнні 22. На падставе пошуку ў базе дадзеных Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) у якасці прамежкавых прадуктаў паміж дыферэнцыяльным метабаломам былі канчаткова адабраны біялагічныя злучэнні з праверанымі стандартамі MS/MS або анатацыямі дакладнага супадзення ў mzCloud (бал > 85) або Chemspider. Анатацыі пікаў для кожнай прыкметы ўключаны ў дадатковыя дадзеныя 3. MetaboAnalyst 5.0 выкарыстоўваўся для ўніварыянтнага аналізу колькасці метабалітаў, нармалізаванай па суме. MetaboAnalyst 5.0 таксама ацэньваў аналіз узбагачэння шляху KEGG на аснове значна розных метабалітаў. Аналіз галоўных кампанент (PCA) і дыскрымінантны аналіз частковых найменшых квадратаў (PLS-DA) аналізаваліся з выкарыстаннем праграмнага пакета ropls (версія 1.26.4) з нармалізацыяй стэка і аўтамаштабаваннем. Аптымальная мадэль біямаркера метабалітаў для прагназавання злаякаснасці вузельчыкаў была створана з выкарыстаннем бінарнай лагістычнай рэгрэсіі з найменшым абсалютным скарачэннем і аператарам адбору (LASSO, пакет R версіі 4.1-3). Прадукцыйнасць дыскрымінантнай мадэлі ў наборах для выяўлення і валідацыі характарызавалася шляхам ацэнкі AUC на аснове ROC-аналізу ў адпаведнасці з пакетам pROC (v.1.18.0.). Аптымальнае значэнне імавернасці было атрымана на аснове максімальнага індэкса Юдэна мадэлі (адчувальнасць + спецыфічнасць – 1). Узоры са значэннямі меншымі або большымі за парог будуць прадказаны як дабраякасныя вузельчыкі і аденокарцынома лёгкіх адпаведна.
Клеткі A549 (#CCL-185, Амерыканская калекцыя тыповых культур) вырошчвалі ў асяроддзі F-12K, якое змяшчала 10% FBS. Паслядоўнасці кароткай шпілекальнай РНК (shRNA), накіраваныя на SLC7A5, і ненацэлевы кантроль (NC), былі ўстаўлены ў лентывірусны вектар pLKO.1-puro. Антысэнсавыя паслядоўнасці shSLC7A5 наступныя: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Антыцелы да SLC7A5 (#5347) і тубуліну (#2148) былі набыты ў Cell Signaling Technology. Антыцелы да SLC7A5 і тубуліну выкарыстоўваліся ў развядзенні 1:1000 для вестэрн-блот-аналізу.
Глікалітычны стрэс-тэст Seahorse XF вымярае ўзровень пазаклеткавай падкісленасці (ECAR). У аналізе глюкоза, алігаміцын А і 2-DG уводзіліся паслядоўна для праверкі глікалітычнай здольнасці клетак, вымеранай з дапамогай ECAR.
Клеткі A549, трансфектаваныя кантролем без мэтавай групы (NC) і shSLC7A5 (Sh1, Sh2), высейвалі на ноч у чашкі дыяметрам 10 см. Клеткавыя метабаліты экстрагавалі 1 мл ледзянога 80% воднага метанолу. Клеткі ў метанольным растворы саскрабалі, збіралі ў новую прабірку і цэнтрыфугавалі пры 15 000 × g на працягу 15 хвілін пры 4°C. Збіралі 800 мкл супернатанту і сушылі з дапамогай высакахуткаснага вакуумнага канцэнтратара. Затым высушаныя гранулы метабалітаў аналізавалі на ўзровень трыптафану з дапамогай LC-MS/MS, як апісана вышэй. Узровень NAD(H) у клетках A549 (NC і shSLC7A5) вымяралі з дапамогай колькаснага каларыметрычнага набору NAD+/NADH (#K337, BioVision) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы. Узровень бялку вымяралі для кожнага ўзору для нармалізацыі колькасці метабалітаў.
Для папярэдняга вызначэння памеру выбаркі не выкарыстоўваліся статыстычныя метады. Папярэднія метабаломныя даследаванні, накіраваныя на выяўленне біямаркераў15,18, разглядаліся ў якасці эталонаў для вызначэння памеру, і ў параўнанні з гэтымі справаздачамі наша выбарка была адэкватнай. З кагорты даследавання не было выключана ніводнага ўзору. Узоры сыроваткі былі выпадковым чынам размеркаваны ў групу выяўлення (306 выпадкаў, 74,6%) і групу ўнутранай валідацыі (104 выпадкі, 25,4%) для нямэтавых метабаломных даследаванняў. Мы таксама выпадковым чынам адабралі 70 выпадкаў з кожнай групы з набору выяўлення для мэтавых метабаломных даследаванняў. Даследчыкі не ведалі размеркавання па групах падчас збору і аналізу дадзеных LC-MS. Статыстычны аналіз дадзеных метабаломікі і клеткавых эксперыментаў апісаны ў адпаведных раздзелах «Вынікі», «Пазнакі малюнкаў» і «Метады». Колькасная ацэнка клеткавага трыптафану, NADT і глікалітычнай актыўнасці праводзілася тры разы незалежна з ідэнтычнымі вынікамі.
Больш падрабязную інфармацыю пра дызайн даследавання глядзіце ў анатацыі справаздачы па натуральным партфелі, звязанай з гэтым артыкулам.
Неапрацаваныя дадзеныя мас-спектрометрыі вынятых прыкмет і нармалізаваныя дадзеныя мас-спектрометрыі эталоннай сыроваткі паказаны ў дадатковых дадзеных 1 і дадатковых дадзеных 2 адпаведна. Анатацыі пікаў для дыферэнцыяльных прыкмет прадстаўлены ў дадатковых дадзеных 3. Набор дадзеных LUAD TCGA можна спампаваць з https://portal.gdc.cancer.gov/. Уваходныя дадзеныя для пабудовы графіка прадстаўлены ў зыходных дадзеных. Зыходныя дадзеныя прадстаўлены для гэтага артыкула.
Нацыянальная група па скрынінгу лёгкіх і інш. Зніжэнне смяротнасці ад раку лёгкіх з дапамогай нізкадознай камп'ютэрнай тамаграфіі. Паўночная Англія. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберле, Д.Р. і Прафет, П.К. Скрынінг рака лёгкіх з выкарыстаннем нізкадознай спіральнай КТ: вынікі Нацыянальнага даследавання скрынінгу лёгкіх (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Дэ Конінг, Х. Дж. і інш. Зніжэнне смяротнасці ад раку лёгкіх з дапамогай аб'ёмнага камп'ютэрнага тамаграфічнага скрынінгу ў рандомізірованном даследаванні. Паўночная Англія. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Час публікацыі: 18 верасня 2023 г.