Дыферэнцыяльная дыягностыка лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай кампутарнай тамаграфіі (КТ), застаецца складанай задачай у клінічнай практыцы.Тут мы ахарактарызуем глабальны метаболом 480 узораў сыроваткі, у тым ліку здаровых людзей кантролю, дабраякасных вузельчыкаў лёгкіх і аденокарциномы лёгкага I стадыі.Аденокарциномы дэманструюць унікальныя метабалічныя профілі, у той час як дабраякасныя вузельчыкі і здаровыя людзі маюць высокае падабенства ў метабалічных профілях.У групе адкрыцця (n = 306) быў ідэнтыфікаваны набор з 27 метабалітаў для дыферэнцыяцыі паміж дабраякаснымі і злаякаснымі вузламі.AUC дыскрымінантнай мадэлі ў групах унутранай праверкі (n = 104) і знешняй праверкі (n = 111) склала 0,915 і 0,945 адпаведна.Аналіз шляхоў выявіў павышэнне глікалітычных метабалітаў, звязаных са зніжэннем трыптафану ў сыроватцы адэнакарцыномы лёгкіх у параўнанні з дабраякаснымі вузельчыкамі і здаровымі людзьмі кантролю, і выказаў здагадку, што паглынанне трыптафану спрыяе гліколізу ў клетках рака лёгкага.Наша даследаванне падкрэслівае значэнне біямаркераў метабалітаў у сыроватцы крыві ў ацэнцы рызыкі лёгачных вузельчыкаў, выяўленых пры КТ.
Ранняя дыягностыка мае вырашальнае значэнне для павышэння ўзроўню выжывальнасці хворых на рак.Вынікі Нацыянальнага даследавання раку лёгкага ў ЗША па скрынінгу (NLST) і Еўрапейскага даследавання NELSON паказалі, што скрынінг з дапамогай камп'ютэрнай тамаграфіі з нізкімі дозамі (LDCT) можа значна знізіць смяротнасць ад раку лёгкіх у групах высокай рызыкі1,2,3.Пасля шырокага выкарыстання LDCT для скрынінга рака лёгкіх частата выпадковых рэнтгеналагічных знаходак бессімптомных лёгачных вузельчыкаў працягвала павялічвацца 4 .Лёгачныя вузлы вызначаюцца як очаговые памутнення да 3 см у дыяметры 5 .Мы сутыкаемся з цяжкасцямі ў ацэнцы верагоднасці злаякаснасці і працы з вялікай колькасцю лёгачных вузельчыкаў, выяўленых выпадкова на LDCT.Абмежаванні КТ могуць прывесці да частых наступных абследаванняў і прытворнададатных вынікаў, што прывядзе да непатрэбнага ўмяшання і празмернага лячэння6.Такім чынам, існуе неабходнасць у распрацоўцы надзейных і карысных біямаркераў для правільнай ідэнтыфікацыі рака лёгкіх на ранніх стадыях і дыферэнцыяцыі большасці дабраякасных вузельчыкаў пры першасным выяўленні 7 .
Комплексны малекулярны аналіз крыві (сыроватка, плазма, монануклеарныя клеткі перыферычнай крыві), уключаючы геноміку, пратэёміку або метыляванне ДНК 8,9,10, прывёў да росту цікавасці да адкрыцця дыягнастычных біямаркераў рака лёгкіх.У той жа час падыходы метабаламікі вымяраюць клеткавыя канчатковыя прадукты, на якія ўплываюць эндагенныя і экзагенныя дзеянні і таму прымяняюцца для прагназавання пачатку і зыходу захворвання.Вадкасная храматаграфія-тандэмная мас-спектраметрыя (ВХ-МС) з'яўляецца шырока выкарыстоўваным метадам метаболомических даследаванняў дзякуючы сваёй высокай адчувальнасці і шырокаму дынамічнаму дыяпазону, які можа ахопліваць метабаліты з рознымі фізіка-хімічнымі ўласцівасцямі 11,12,13.Нягледзячы на тое, што глабальны метабаламічны аналіз плазмы/сыроваткі выкарыстоўваўся для ідэнтыфікацыі біямаркераў, звязаных з дыягностыкай рака лёгкіх 14,15,16,17 і эфектыўнасцю лячэння,18 класіфікатары сыроватачных метабалітаў для адрознення дабраякасных і злаякасных вузельчыкаў лёгкіх яшчэ трэба будзе значна вывучыць.-масавыя даследаванні.
Аденокарцинома і плоскоклеточный рак з'яўляюцца двума асноўнымі падтыпамі немелкоклеточного рака лёгкага (НМРЛ).Розныя скрынінгавыя тэсты КТ паказваюць, што аденокарцинома з'яўляецца найбольш распаўсюджаным гістолагічным тыпам рака лёгкага1,19,20,21.У гэтым даследаванні мы выкарыстоўвалі звышпрадукцыйную вадкасную храматаграфію з мас-спектраметрыяй высокага раздзялення (UPLC-HRMS) для правядзення метаболомического аналізу ў агульнай складанасці 695 узораў сыроваткі, уключаючы здаровыя кантрольныя ўзоры, дабраякасныя лёгачныя вузельчыкі і выяўленыя пры КТ ≤3 см.Скрынінг аденокарциномы лёгкага I стадыі.Мы ідэнтыфікавалі групу сыроватачных метабалітаў, якія адрозніваюць адэнакарцыному лёгкіх ад дабраякасных вузельчыкаў і здаровых асоб.Аналіз узбагачэння шляху паказаў, што анамальны метабалізм трыптафану і глюкозы з'яўляюцца агульнымі зменамі пры аденокарциноме лёгкага ў параўнанні з дабраякаснымі вузельчыкамі і здаровымі людзьмі кантролю.Нарэшце, мы стварылі і пацвердзілі метабалічны класіфікатар сыроваткі з высокай спецыфічнасцю і адчувальнасцю для адрознення злаякасных і дабраякасных лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай LDCT, што можа дапамагчы ў ранняй дыферэнцыяльнай дыягностыцы і ацэнцы рызыкі.
У бягучым даследаванні ўзоры сыроваткі, якія адпавядаюць полу і ўзросту, былі рэтраспектыўна сабраныя ў 174 здаровых асоб, 292 пацыентаў з дабраякаснымі лёгачнымі вузельчыкамі і 229 пацыентаў з аденокарциномой лёгкага I стадыі.Дэмаграфічныя характарыстыкі 695 суб'ектаў паказаны ў дадатковай табліцы 1.
Як паказана на малюнку 1а, у агульнай складанасці 480 узораў сыроваткі, у тым ліку 174 здаровых кантрольных (HC), 170 дабраякасных вузельчыкаў (BN) і 136 узораў адэнакарцыномы лёгкага (LA) I стадыі, былі сабраны ў анкалагічным цэнтры Універсітэта Сунь Ятсена.Кагорта адкрыццяў для ненакіраванага метабаламічнага прафілявання з выкарыстаннем звышпрадукцыйнай вадкаснай храматаграфіі з мас-спектраметрыяй высокага раздзялення (UPLC-HRMS).Як паказана на дадатковым малюнку 1, дыферэнцыяльныя метабаліты паміж LA і HC, LA і BN былі вызначаны для стварэння мадэлі класіфікацыі і далейшага вывучэння дыферэнцыяльнага аналізу шляху.104 пробы, сабраныя анкалагічным цэнтрам Універсітэта Сунь Ятсена, і 111 узораў, сабраныя дзвюма іншымі бальніцамі, былі падвергнуты ўнутранай і знешняй праверцы адпаведна.
Даследаваная папуляцыя ў кагорце адкрыццяў, якая прайшла глабальны метабаламічны аналіз сыроваткі з выкарыстаннем звышэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі з мас-спектраметрыяй высокага раздзялення (UPLC-HRMS).b Дыскрымінантны аналіз частковых найменшых квадратаў (PLS-DA) агульнага метаболома 480 узораў сыроваткі з доследнай кагорты, уключаючы здаровых людзей кантролю (HC, n = 174), дабраякасныя вузельчыкі (BN, n = 170) і аденокарциному лёгкага I стадыі (Лос-Анджэлес, n = 136).+ESI, рэжым станоўчай іянізацыі электрараспыленнем, -ESI, рэжым адмоўнай іянізацыі электрараспыленнем.c–e Метабаліты са значна рознымі ўтрыманнямі ў дзвюх дадзеных групах (двухбаковы рэйтынгавы тэст Уілкаксана, скарэкціраванае значэнне р на частату ілжывых адкрыццяў, FDR <0,05) паказаны чырвоным (кратнае змяненне > 1,2) і сінім (кратнае змяненне <0,83) .), паказаны на графіку вулкана.f Цеплавая карта іерархічнай кластарызацыі, якая паказвае значныя адрозненні ў колькасці анатаваных метабалітаў паміж LA і BN.Зыходныя даныя падаюцца ў выглядзе файлаў зыходных даных.
Агульны сыроватачна метаболом 174 HC, 170 BN і 136 LA ў групе адкрыцця быў прааналізаваны з дапамогай аналізу UPLC-HRMS.Спачатку мы паказваем, што ўзоры кантролю якасці (КК) цесна згрупаваны ў цэнтры мадэлі некантраляванага аналізу галоўных кампанентаў (PCA), што пацвярджае стабільнасць прадукцыйнасці бягучага даследавання (дадатковы малюнак 2).
Як паказана ў дыскрымінантным аналізе частковых найменшых квадратаў (PLS-DA) на малюнку 1b, мы выявілі відавочныя адрозненні паміж LA і BN, LA і HC у станоўчым (+ESI) і адмоўным (−ESI) рэжымах іянізацыі электрараспыленнем .ізаляваны.Аднак значных адрозненняў паміж BN і HC ва ўмовах +ESI і -ESI не выяўлена.
Мы знайшлі 382 дыферэнцыяльныя прыкметы паміж LA і HC, 231 дыферэнцыяльныя прыкметы паміж LA і BN і 95 дыферэнцыяльных прыкмет паміж BN і HC (тэст Уілкаксана са знакавым рангам, FDR <0,05 і множныя змены >1,2 або <0,83) (малюнак .1c-e )..Пікі былі дадаткова анатаваныя (дадатковыя дадзеныя 3) у базе дадзеных (бібліятэка mzCloud/HMDB/Chemspider) па значэнні m/z, часу ўтрымання і пошуку мас-спектру фрагментацыі (падрабязнасці апісаны ў раздзеле «Метады») 22 .Нарэшце, 33 і 38 анатаваных метабалітаў са значнымі адрозненнямі ў колькасці былі ідэнтыфікаваны для LA супраць BN (малюнак 1f і дадатковая табліца 2) і LA супраць HC (дадатковы малюнак 3 і дадатковая табліца 2), адпаведна.Наадварот, толькі 3 метабаліты са значнымі адрозненнямі ў колькасці былі выяўлены ў BN і HC (дадатковая табліца 2), што адпавядае перакрыццю паміж BN і HC у PLS-DA.Гэтыя дыферэнцыяльныя метабаліты ахопліваюць шырокі спектр біяхімічных рэчываў (дадатковы малюнак 4).У сукупнасці гэтыя вынікі дэманструюць значныя змены ў сыроватачна метаболоме, якія адлюстроўваюць злаякасную трансфармацыю рака лёгкага на ранняй стадыі ў параўнанні з дабраякаснымі вузельчыкамі лёгкіх або здаровымі суб'ектамі.У той жа час падабенства сыроватачна метаболома BN і HC сведчыць аб тым, што дабраякасныя лёгачныя вузельчыкі могуць мець шмат агульных біялагічных характарыстык са здаровымі людзьмі.Улічваючы, што мутацыі гена рэцэптара эпідэрмальнага фактару росту (EGFR) часта сустракаюцца ў аденокарциноме лёгкага падтыпу 23, мы імкнуліся вызначыць уплыў мутацый драйвера на сыроватачна метаболом.Затым мы прааналізавалі агульны метабалічны профіль 72 выпадкаў са статусам EGFR у групе аденокарциномы лёгкіх.Цікава, што мы выявілі параўнальныя профілі паміж пацыентамі-мутантамі EGFR (n = 41) і пацыентамі дзікага тыпу EGFR (n = 31) у аналізе PCA (дадатковы малюнак 5a).Тым не менш, мы вызначылі 7 метабалітаў, колькасць якіх значна змянілася ў пацыентаў з мутацыяй EGFR у параўнанні з пацыентамі з EGFR дзікага тыпу (t-тэст, p <0,05 і кратнае змяненне> 1,2 або <0,83) (дадатковы малюнак 5b).Большасць гэтых метабалітаў (5 з 7) - гэта ацылкарнітыны, якія гуляюць важную ролю ў шляхах акіслення тоўстых кіслот.
Як паказана ў працоўным працэсе, паказаным на малюнку 2 а, біямаркеры для класіфікацыі вузельчыкаў былі атрыманы з выкарыстаннем аператараў найменшага абсалютнага ўсаджвання і адбору на аснове 33 дыферэнцыяльных метабалітаў, выяўленых у LA (n = 136) і BN (n = 170).Найлепшае спалучэнне зменных (LASSO) - бінарная мадэль лагістычнай рэгрэсіі.Для праверкі надзейнасці мадэлі выкарыстоўвалася дзесяціразовая крыжаваная праверка.Выбар зменных і рэгулярізацыя параметраў карэктуюцца з дапамогай штрафу за максімізацыю верагоднасці з параметрам λ24.Аналіз глабальнай метабаламікі быў дадаткова праведзены незалежна ў групах унутранай праверкі (n = 104) і знешняй праверкі (n = 111), каб праверыць прадукцыйнасць класіфікацыі дыскрымінантнай мадэлі.У выніку 27 метабалітаў у наборы адкрыццяў былі ідэнтыфікаваны як лепшая дыскрымінантная мадэль з самым вялікім сярэднім значэннем AUC (мал. 2b), сярод якіх 9 мелі павышаную актыўнасць і 18 паніжаную актыўнасць у LA ў параўнанні з BN (мал. 2c).
Рабочы працэс для стварэння класіфікатара лёгачных вузельчыкаў, уключаючы выбар найлепшай панэлі сыроватачных метабалітаў у наборы адкрыццяў з выкарыстаннем двайковай мадэлі лагістычнай рэгрэсіі з дапамогай дзесяціразовай перакрыжаванай праверкі і ацэнку прагнастычнай эфектыўнасці ва ўнутраных і знешніх наборах праверкі.b Статыстыка перакрыжаванай праверкі рэгрэсійнай мадэлі LASSO для выбару метабалічных біямаркераў.Прыведзеныя вышэй лічбы ўяўляюць сабой сярэднюю колькасць біямаркераў, выбраных пры дадзеным λ.Чырвоная пункцірная лінія ўяўляе сярэдняе значэнне AUC пры адпаведнай лямбда.Шэрыя паласы памылак адлюстроўваюць мінімальныя і максімальныя значэнні AUC.Пункцірнай лініяй пазначана лепшая мадэль з 27 выбранымі биомаркерами.AUC, плошча пад крывой працоўнай характарыстыкі рэсівера (ROC).c Кратныя змены 27 выбраных метабалітаў у групе LA у параўнанні з групай BN у групе адкрыцця.Чырвоная калонка - актывацыя.Сіні слупок - спад.d–f Крывыя працоўных характарыстык прыёмніка (ROC), якія паказваюць магутнасць дыскрымінантнай мадэлі, заснаванай на 27 камбінацыях метабалітаў у наборах адкрыцця, унутранай і знешняй праверкі.Зыходныя даныя падаюцца ў выглядзе файлаў зыходных даных.
Мадэль прагназавання была створана на аснове ўзважаных каэфіцыентаў рэгрэсіі гэтых 27 метабалітаў (дадатковая табліца 3).Аналіз ROC на аснове гэтых 27 метабалітаў даў значэнне плошчы пад крывой (AUC) 0,933, адчувальнасць групы адкрыцця была 0,868, а спецыфічнасць - 0,859 (мал. 2d).Між тым, сярод 38 анатаваных дыферэнцыяльных метабалітаў паміж LA і HC, набор з 16 метабалітаў дасягнуў AUC 0,902 з адчувальнасцю 0,801 і спецыфічнасцю 0,856 пры адрозненні LA ад HC (дадатковы малюнак 6a-c).Таксама параўноўваліся значэнні AUC, заснаваныя на розных парогавых значэннях змены кратнасці для дыферэнцыяльных метабалітаў.Мы выявілі, што мадэль класіфікацыі лепш за ўсё адрознівае LA і BN (HC), калі ўзровень змены складчатасці быў усталяваны на 1,2 супраць 1,5 або 2,0 (дадатковы малюнак 7a,b).Мадэль класіфікацыі, заснаваная на 27 групах метабалітаў, была дадаткова праверана ва ўнутраных і знешніх кагортах.AUC склаў 0,915 (адчувальнасць 0,867, спецыфічнасць 0,811) для ўнутранай праверкі і 0,945 (адчувальнасць 0,810, спецыфічнасць 0,979) для знешняй праверкі (мал. 2e, f).Для ацэнкі міжлабараторнай эфектыўнасці 40 узораў са знешняй кагорты былі прааналізаваны ў знешняй лабараторыі, як апісана ў раздзеле «Метады».Дакладнасць класіфікацыі дасягнула AUC 0,925 (дадатковы малюнак 8).Паколькі плоскоклеточный рак лёгкага (LUSC) з'яўляецца другім па распаўсюджанасці падтыпам немелкоклеточного рака лёгкага (NSCLC) пасля аденокарциномы лёгкага (LUAD), мы таксама праверылі пацверджаную патэнцыйную карыснасць метабалічных профіляў.БН і 16 выпадкаў ЛУСК.AUC дыскрымінацыі паміж LUSC і BN склаў 0,776 (дадатковы малюнак 9), што паказвае на горшую здольнасць у параўнанні з дыскрымінацыяй паміж LUAD і BN.
Даследаванні паказалі, што памер вузельчыкаў на здымках КТ станоўча карэлюе з верагоднасцю злаякаснай пухліны і застаецца асноўным фактарам, вызначальным пры лячэнні вузельчыкаў25,26,27.Аналіз дадзеных вялікай кагорты скрынінгавых даследаванняў NELSON паказаў, што рызыка злаякаснай пухліны ў суб'ектаў з вузламі <5 мм быў нават падобны да рызыкі ў суб'ектаў без вузлоў 28 .Такім чынам, мінімальны памер, які патрабуе рэгулярнага КТ-кантролю, складае 5 мм, як рэкамендуе Брытанскае таракальнае таварыства (BTS), і 6 мм, як рэкамендуе Таварыства Флейшнера 29 .Аднак вузельчыкі памерам больш за 6 мм і без відавочных дабраякасных прыкмет, якія называюцца нявызначанымі лёгачнымі вузламі (IPN), застаюцца сур'ёзнай праблемай пры ацэнцы і лячэнні ў клінічнай практыцы30,31.Затым мы вывучылі, ці ўплывае памер вузельчыкаў на метабаламічныя сігнаты, выкарыстоўваючы аб'яднаныя ўзоры з кагорт адкрыцця і ўнутранай праверкі.Засяродзіўшыся на 27 пацверджаных біямаркерах, мы спачатку параўналі профілі PCA метаболомов HC і BN ніжэй за 6 мм.Мы выявілі, што большасць кропак дадзеных для HC і BN перакрываюцца, дэманструючы, што ўзровень сыроватачна метабалітаў былі аднолькавымі ў абедзвюх групах (мал. 3a).Карты функцый у розных дыяпазонах памераў заставаліся захаванымі ў BN і LA (мал. 3b, c), у той час як назіралася падзел паміж злаякаснымі і дабраякаснымі вузламі ў дыяпазоне 6-20 мм (мал. 3d).Гэтая кагорта мела AUC 0,927, спецыфічнасць 0,868 і адчувальнасць 0,820 для прагназавання злаякаснасці вузельчыкаў памерам ад 6 да 20 мм (мал. 3e, f).Нашы вынікі паказваюць, што класіфікатар можа фіксаваць метабалічныя змены, выкліканыя ранняй злаякаснай трансфармацыяй, незалежна ад памеру вузельчыка.
ad Параўнанне профіляў PCA паміж названымі групамі на аснове метабалічнага класіфікатара 27 метабалітаў.CC і BN < 6 мм.b BN < 6 мм супраць BN 6–20 мм.у ЛА 6-20 мм супраць ЛА 20-30 мм.г БН 6–20 мм і ЛА 6–20 мм.GC, n = 174;BN < 6 мм, n = 153;БН 6–20 мм, п = 91;ЛА 6–20 мм, n = 89;LA 20–30 мм, n = 77. e Крывая працоўнай характарыстыкі прыёмніка (ROC), якая паказвае характарыстыкі дыскрымінантнай мадэлі для вузельчыкаў 6–20 мм.f Значэнні верагоднасці былі разлічаны на аснове мадэлі лагістычнай рэгрэсіі для вузельчыкаў памерам 6-20 мм.Шэрая пункцірная лінія ўяўляе аптымальнае лімітавае значэнне (0,455).Прыведзеныя вышэй лічбы ўяўляюць працэнт выпадкаў, прагназуемых для Лос-Анджэлеса.Выкарыстоўвайце двухбаковы крытэр Ст'юдэнта.PCA, аналіз галоўных кампанентаў.Плошча AUC пад крывой.Зыходныя даныя падаюцца ў выглядзе файлаў зыходных даных.
Чатыры ўзоры (ва ўзросце 44-61 года) з аднолькавымі памерамі лёгачных вузельчыкаў (7-9 мм) былі далей адабраны, каб праілюстраваць эфектыўнасць прапанаванай мадэлі прагназавання злаякасных пухлін (мал. 4а, б).Пры першапачатковым абследаванні выпадак 1 быў прадстаўлены ў выглядзе цвёрдага вузельчыка з кальцынатам, прыкметай, звязанай з дабраякаснасцю, у той час як выпадак 2 быў прадстаўлены як нявызначаны часткова цвёрды вузельчык без відавочных дабраякасных прыкмет.Тры раўнды наступных КТ паказалі, што гэтыя выпадкі заставаліся стабільнымі на працягу 4-гадовага перыяду і таму лічыліся дабраякаснымі вузламі (мал. 4а).У параўнанні з клінічнай ацэнкай серыйных КТ, аналіз метабалітаў сыроваткі за адзін раз з дапамогай бягучай мадэлі класіфікатара хутка і правільна ідэнтыфікаваў гэтыя дабраякасныя вузельчыкі на падставе імавернасных абмежаванняў (табліца 1).На малюнку 4b у выпадку 3 паказаны вузельчык з прыкметамі плеўральнай ретракціі, якая часцей за ўсё звязана са злаякаснай пухлінай32.Выпадак 4 прадстаўлены як нявызначаны часткова цвёрды вузельчык без доказаў дабраякаснай прычыны.Усе гэтыя выпадкі былі прагназаваны як злаякасныя ў адпаведнасці з мадэллю класіфікатара (табл. 1).Ацэнка аденокарциномы лёгкага была прадэманстравана гистопатологическим даследаваннем пасля аперацыі рэзекцыі лёгкага (мал. 4b).Для вонкавага набору праверкі метабалічны класіфікатар дакладна прадказаў два выпадкі нявызначаных вузельчыкаў у лёгкіх памерам больш за 6 мм (дадатковы малюнак 10).
КТ выявы восевага акна лёгкіх двух выпадкаў дабраякасных вузельчыкаў.У выпадку 1 КТ праз 4 гады паказала стабільны цвёрды вузельчык памерам 7 мм з кальцынатам у правай ніжняй долі.У выпадку 2 КТ праз 5 гадоў выявіла стабільны, часткова салідны вузел дыяметрам 7 мм у правай верхняй долі.b КТ лёгкіх у восевым акне і адпаведныя паталагічныя даследаванні двух выпадкаў аденокарциномы I стадыі перад рэзекцыяй лёгкага.Выпадак 3 выявіў вузельчык дыяметрам 8 мм у правай верхняй долі з плеўральнай втяжением.Выпадак 4 выявіў часткова цвёрды вузельчык памерам 9 мм у левай верхняй долі.Афарбоўванне гематоксилином і эозином (H&E) рэзецыраванай лёгачнай тканіны (шкала = 50 мкм), што дэманструе ацынарны характар росту аденокарциномы лёгкага.Стрэлкамі паказаны вузельчыкі, выяўленыя на здымках КТ.Выявы H&E - гэта рэпрэзентатыўныя выявы некалькіх (>3) мікраскапічных палёў, агледжаных патолагаанатамам.
У сукупнасці нашы вынікі дэманструюць патэнцыйную каштоўнасць біямаркераў метабалітаў сыроваткі ў дыферэнцыяльнай дыягностыцы лёгачных вузельчыкаў, што можа выклікаць праблемы пры ацэнцы КТ-скрынінгу.
На падставе пацверджанай панэлі дыферэнцыяльных метабалітаў мы імкнуліся вызначыць біялагічныя карэляты асноўных метабалічных змен.Аналіз ўзбагачэння шляху KEGG, праведзены MetaboAnalyst, выявіў 6 агульных значна змененых шляхоў паміж дзвюма дадзенымі групамі (LA супраць HC і LA супраць BN, скарэкціраваны p ≤ 0,001, эфект > 0,01).Гэтыя змены характарызаваліся парушэннямі метабалізму пирувата, трыптафану, метабалізму ніацін і никотинамида, гліколізу, цыклу ТЦА і метабалізму пуринов (мал. 5а).Затым мы дадаткова правялі мэтанакіраваную метаболіку, каб праверыць асноўныя змены з дапамогай абсалютнай колькаснай ацэнкі.Вызначэнне агульных метабалітаў у звычайна змененых шляхах з дапамогай патройнай квадрупольнай мас-спектраметрыі (QQQ) з выкарыстаннем сапраўдных стандартаў метабалітаў.Дэмаграфічныя характарыстыкі мэтавага ўзору метабаломічнага даследавання ўключаны ў Дадатковую табліцу 4. У адпаведнасці з нашымі глабальнымі вынікамі метабаламікі, колькасны аналіз пацвердзіў, што гіпаксанцін і ксанцін, піруват і лактат былі павышаны ў LA у параўнанні з BN і HC (мал. 5b, c, p <0,05).Аднак істотных адрозненняў у гэтых метабалітах паміж BN і HC не выяўлена.
Аналіз ўзбагачэння шляху KEGG значна адрозніваюцца метабалітамі ў групе LA у параўнанні з групамі BN і HC.Выкарыстоўваўся двухбаковы Globaltest, а значэнні р былі скарэкціраваны з дапамогай метаду Хольма-Банфероні (скарэкціраваны р ≤ 0,001 і памер эфекту> 0,01).b–d Графікі Скрыпкі, якія паказваюць узровень гіпаксантыну, ксантыну, лактата, пірувата і трыптафану ў сыроватцы крыві HC, BN і LA, вызначаныя з дапамогай LC-MS/MS (n = 70 на групу).Белыя і чорныя пункцірныя лініі паказваюць медыяну і квартыль адпаведна.e Графік Violin, які паказвае нармалізаваную экспрэсію мРНК Log2TPM (транскрыптаў на мільён) SLC7A5 і QPRT у адэнакарцыноме лёгкіх (n = 513) у параўнанні з нармальнай тканінай лёгкіх (n = 59) у наборы даных LUAD-TCGA.Белае поле ўяўляе інтэрквартыльны дыяпазон, гарызантальная чорная лінія ў цэнтры ўяўляе медыяну, а вертыкальная чорная лінія, якая ідзе ад поля, уяўляе сабой 95% даверны інтэрвал (ДІ).f Графік карэляцыі Пірсана экспрэсіі SLC7A5 і GAPDH у аденокарциноме лёгкага (n = 513) і нармальнай тканіны лёгкага (n = 59) у наборы дадзеных TCGA.Шэрая зона ўяўляе сабой 95% дзі.r, каэфіцыент карэляцыі Пірсана.g Нармалізаваны клеткавы ўзровень трыптафану ў клетках A549, трансфікаваных неспецыфічным кантролем shRNA (NC) і shSLC7A5 (Sh1, Sh2), вызначаны з дапамогай ВХ-МС/МС.Прадстаўлены статыстычны аналіз пяці біялагічна незалежных узораў у кожнай групе.h Клеткавыя ўзроўні NADt (агульны NAD, уключаючы NAD+ і NADH) у клетках A549 (NC) і клетках A549 з накдаўнам SLC7A5 (Sh1, Sh2).Прадстаўлены статыстычны аналіз трох біялагічна незалежных узораў у кожнай групе.i Глікалітычная актыўнасць клетак A549 да і пасля накдаўну SLC7A5 вымяралася па хуткасці пазаклеткавага падкіслення (ECAR) (n = 4 біялагічна незалежныя ўзоры на групу).2-DG,2-дезокси-D-глюкоза.Двухбаковы крытэр Ст'юдэнта быў выкарыстаны ў (b–h).У (g–i) паласы памылак уяўляюць сярэдняе ± SD, кожны эксперымент праводзіўся тры разы незалежна, і вынікі былі аднолькавымі.Зыходныя даныя падаюцца ў выглядзе файлаў зыходных даных.
Улічваючы значны ўплыў змененага метабалізму трыптафану ў групе LA, мы таксама ацанілі ўзроўні трыптафану ў сыроватцы крыві ў групах HC, BN і LA з дапамогай QQQ.Мы выявілі, што трыптафан у сыроватцы крыві быў зніжаны ў LA у параўнанні з HC або BN (p <0,001, малюнак 5d), што ўзгадняецца з папярэднімі высновамі аб тым, што ўзроўні цыркулявалага трыптафану ніжэй у пацыентаў з ракам лёгкіх, чым у здаровых кантрольных груп33,34 ,35.Іншае даследаванне з выкарыстаннем ПЭТ/КТ-індикатора 11C-пазначаў-L-трыптафану паказала, што час утрымання сігналу трыптафану ў тканінах рака лёгкага значна павялічыўся ў параўнанні з дабраякаснымі паразамі або нармальнай тканінай36.Мы мяркуем, што зніжэнне трыптафану ў сыроватцы LA можа адлюстроўваць актыўнае паглынанне трыптафану клеткамі рака лёгкага.
Таксама вядома, што канчатковым прадуктам кинуренинового шляху катабалізму трыптафану з'яўляецца NAD+37,38, які з'яўляецца важным субстратам для рэакцыі глицеральдегид-3-фасфату з 1,3-бисфосфоглицератом ў працэсе гликолиза39.У той час як папярэднія даследаванні былі сканцэнтраваны на ролі катабалізму трыптафану ў імуннай рэгуляцыі, мы імкнуліся высветліць ўзаемасувязь паміж парушэннем рэгуляцыі трыптафану і глікалітычнымі шляхамі, якія назіраліся ў бягучым даследаванні.Вядома, што член 5 сямейства пераносчыкаў раствораных рэчываў 7 (SLC7A5) з'яўляецца пераносчыкам трыптафану43,44,45.Фасфарыбазілтрансфераза хіналінавай кіслаты (QPRT) - гэта фермент, размешчаны ніжэй па плыні кінурэнінавага шляху, які ператварае хіналінавую кіслату ў NAMN46.Праверка набору даных LUAD TCGA паказала, што і SLC7A5, і QPRT значна павышаюць рэгуляцыю ў пухліннай тканіны ў параўнанні з нармальнай тканінай (мал. 5e).Гэта павелічэнне назіралася на стадыях I і II, а таксама на стадыях III і IV аденокарциномы лёгкага (дадатковы малюнак 11), што паказвае на раннія парушэнні метабалізму трыптафану, звязаныя з опухолеобразованием.
Акрамя таго, набор даных LUAD-TCGA паказаў станоўчую карэляцыю паміж экспрэсіяй мРНК SLC7A5 і GAPDH ва ўзорах хворых на рак (r = 0,45, p = 1,55E-26, малюнак 5f).Наадварот, не было выяўлена значнай карэляцыі паміж такімі прыкметамі генаў у нармальнай лёгачнай тканіны (r = 0,25, p = 0,06, малюнак 5f).Накдаўн SLC7A5 (дадатковы малюнак 12) у клетках A549 значна зніжае клеткавы ўзровень трыптафану і NAD(H) (малюнак 5g,h), што прыводзіць да аслаблення глікалітычнай актыўнасці, вымеранай хуткасцю пазаклеткавага падкіслення (ECAR) (малюнак 1).5і).Такім чынам, грунтуючыся на метабалічных зменах у сыроватцы і выяўленні in vitro, мы мяркуем, што метабалізм трыптафану можа вырабляць NAD+ праз кинурениновый шлях і гуляць важную ролю ў садзейнічанні гліколізу пры раку лёгкіх.
Даследаванні паказалі, што вялікая колькасць нявызначаных лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай LDCT, можа прывесці да неабходнасці дадатковага абследавання, напрыклад, ПЭТ-КТ, біяпсіі лёгкіх і празмернага лячэння з-за прытворнададатнага дыягназу злаякаснай пухліны.31 Як паказана на малюнку 6, наша даследаванне вызначыла групу сыроватачных метабалітаў з патэнцыйнай дыягнастычнай каштоўнасцю, якая можа палепшыць стратыфікацыю рызыкі і наступнае лячэнне лёгачных вузельчыкаў, выяўленых пры КТ.
Лёгачныя вузельчыкі ацэньваюцца з дапамогай камп'ютэрнай тамаграфіі з нізкімі дозамі (LDCT) з функцыямі візуалізацыі, якія сведчаць аб дабраякасных або злаякасных прычынах.Нявызначаны вынік вузельчыкаў можа прывесці да частых наступных візітаў, непатрэбных умяшанняў і празмернага лячэння.Уключэнне сыроватачных метабалічных класіфікатараў з дыягнастычнай каштоўнасцю можа палепшыць ацэнку рызыкі і наступнае лячэнне лёгачных вузельчыкаў.ПЭТ пазітронна-эмісійная тамаграфія.
Дадзеныя амерыканскага даследавання NLST і еўрапейскага даследавання NELSON паказваюць, што скрынінг груп высокай рызыкі з дапамогай камп'ютэрнай тамаграфіі з нізкімі дозамі (LDCT) можа знізіць смяротнасць ад раку лёгкіх1,3.Аднак ацэнка рызыкі і наступнае клінічнае лячэнне вялікай колькасці выпадковых лёгачных вузельчыкаў, выяўленых з дапамогай LDCT, застаюцца найбольш складанымі.Асноўная мэта - аптымізаваць правільную класіфікацыю існуючых пратаколаў на аснове LDCT шляхам уключэння надзейных біямаркераў.
Пэўныя малекулярныя біямаркеры, такія як метабаліты крыві, былі ідэнтыфікаваныя шляхам параўнання рака лёгкіх са здаровымі людзьмі15,17.У цяперашнім даследаванні мы засяродзіліся на прымяненні аналізу метабаламікі сыроваткі крыві, каб адрозніць дабраякасныя і злаякасныя лёгачныя вузлы, выпадкова выяўленыя з дапамогай LDCT.Мы параўналі глабальны метаболом сыроваткі здаровага кантролю (HC), дабраякасных вузельчыкаў лёгкіх (BN) і адэнакарцыномы лёгкага I стадыі (LA) з дапамогай аналізу UPLC-HRMS.Мы выявілі, што HC і BN мелі падобныя метабалічныя профілі, тады як LA паказала значныя змены ў параўнанні з HC і BN.Мы вызначылі два набору сыроватачна метабалітаў, якія адрозніваюць LA ад HC і BN.
Сучасная схема ідэнтыфікацыі дабраякасных і злаякасных вузельчыкаў на аснове LDCT у асноўным заснавана на памеры, шчыльнасці, марфалогіі і хуткасці росту вузельчыкаў з цягам часу30.Папярэднія даследаванні паказалі, што памер вузельчыкаў цесна звязаны з верагоднасцю рака лёгкіх.Нават у пацыентаў з высокай рызыкай рызыка малігнізацыю ў вузлах <6 мм складае <1%.Рызыка малігнізацыю вузельчыкаў памерам ад 6 да 20 мм вагаецца ад 8% да 64%30.Такім чынам, таварыства Флейшнера рэкамендуе дыяметр адрэзу 6 мм для звычайнага кантролю на КТ.29 Тым не менш, ацэнка рызыкі і лячэнне нявызначаных лёгачных вузельчыкаў (IPN) памерам больш за 6 мм не праводзіліся належным чынам 31 .Сучаснае лячэнне прыроджаных парокаў сэрца звычайна заснавана на ўважлівым чаканні з частым кантролем КТ.
На аснове пацверджанага метаболома мы ўпершыню прадэманстравалі супадзенне метабаламічных прыкмет паміж здаровымі людзьмі і дабраякаснымі вузельчыкамі <6 мм.Біялагічнае падабенства ўзгадняецца з папярэднімі вынікамі КТ, што рызыка злаякаснай пухліны для вузельчыкаў <6 мм гэтак жа нізкі, як і для суб'ектаў без вузлоў.30 Варта адзначыць, што нашы вынікі таксама дэманструюць, што дабраякасныя вузельчыкі <6 мм і ≥6 мм маюць высокую падабенства ў метаболических профілях, што сведчыць аб тым, што функцыянальнае вызначэнне дабраякаснай этыялогіі паслядоўна незалежна ад памеру вузельчыка.Такім чынам, сучасныя дыягнастычныя панэлі метабалітаў у сыроватцы крыві могуць даць адзіны аналіз у якасці выключанага тэсту, калі вузельчыкі першапачаткова выяўляюцца на КТ, і патэнцыйна паменшыць серыйны маніторынг.У той жа час тая ж панэль метабалічных біямаркераў адрознівала злаякасныя вузельчыкі памерам ≥6 мм ад дабраякасных вузельчыкаў і забяспечвала дакладныя прагнозы IPN падобнага памеру і неадназначных марфалагічных прыкмет на здымках КТ.Гэты класіфікатар сыроватачна метабалізму добра паказаў злаякаснасць вузельчыкаў ≥6 мм з AUC 0,927.У сукупнасці нашы вынікі паказваюць, што унікальныя метабалічныя прыкметы сыроваткі крыві могуць у прыватнасці адлюстроўваць раннія метабалічныя змены, выкліканыя пухлінай, і мець патэнцыйнае значэнне ў якасці прэдыктараў рызыкі, незалежна ад памеру вузельчыка.
Характэрна, што аденокарцинома лёгкага (LUAD) і плоскоклеточный рак (LUSC) з'яўляюцца асноўнымі тыпамі немелкоклеточного рака лёгкага (НМРЛ).Улічваючы, што LUSC цесна звязаны з ужываннем тытуню47 і LUAD з'яўляецца найбольш распаўсюджанай гісталогіяй выпадковых вузельчыкаў лёгкіх, выяўленых пры КТ-скрынінгу48, наша мадэль класіфікатара была спецыяльна створана для узораў аденокарциномы стадыі I.Ван і яго калегі таксама засяродзіліся на LUAD і вызначылі дзевяць ліпідных прыкмет з дапамогай ліпідамікі, каб адрозніць раннюю стадыю рака лёгкіх ад здаровых людзей17.Мы пратэставалі бягучую мадэль класіфікатара на 16 выпадках I стадыі LUSC і 74 дабраякасных вузельчыках і назіралі нізкую дакладнасць прагназавання LUSC (AUC 0,776), што дазваляе выказаць здагадку, што LUAD і LUSC могуць мець уласныя метабаламічныя прыкметы.Сапраўды, было паказана, што LUAD і LUSC адрозніваюцца этыялогіяй, біялагічным паходжаннем і генетычнымі аберацыямі49.Такім чынам, іншыя тыпы гісталогіі павінны быць уключаны ў навучальныя мадэлі для папуляцыйнага выяўлення рака лёгкага ў праграмах скрынінга.
Тут мы вызначылі шэсць найбольш часта змененых шляхоў пры аденокарциноме лёгкага ў параўнанні са здаровымі людзьмі кантролю і дабраякаснымі вузельчыкамі.Ксантин і гіпаксанцін з'яўляюцца агульнымі метабалітамі пурынавых метабалічнага шляху.У адпаведнасці з нашымі вынікамі, прамежкавыя прадукты, звязаныя з метабалізмам пуринов, значна павялічыліся ў сыроватцы або тканінах пацыентаў з аденокарциномой лёгкіх у параўнанні са здаровымі людзьмі або пацыентамі на преинвазивной стадыі 15,50.Павышаныя ўзроўні ксантыну і гіпаксантыну ў сыроватцы крыві могуць адлюстроўваць анабалізм, неабходны для хутка размнажальных ракавых клетак.Парушэнне рэгуляцыі метабалізму глюкозы з'яўляецца добра вядомай адметнай рысай метабалізму рака51.Тут мы назіралі значнае павелічэнне пірувата і лактата ў групе LA у параўнанні з групай HC і BN, што супадае з папярэднімі паведамленнямі аб парушэннях глікалітычнага шляху ў профілях сыроватачна метаболома пацыентаў з немелкоклеточным ракам лёгкага (НМРЛ) і здаровы кантроль.вынікі адпавядаюць52,53.
Важна адзначыць, што мы назіралі зваротную карэляцыю паміж метабалізмам пирувата і трыптафану ў сыроватцы крыві аденокарциномы лёгкіх.Сыроватачны ўзровень трыптафану быў зніжаны ў групе LA у параўнанні з групай HC або BN.Цікава, што папярэдняе буйнамаштабнае даследаванне з выкарыстаннем праспектыўнай кагорты выявіла, што нізкі ўзровень цыркулявалага трыптафану быў звязаны з павышаным рызыкай рака лёгкіх 54 .Трыптафан - незаменная амінакіслата, якую мы цалкам атрымліваем з ежай.Мы прыйшлі да высновы, што знясіленне трыптафану ў сыроватцы крыві пры аденокарциноме лёгкага можа адлюстроўваць хуткае знясіленне гэтага метабаліту.Добра вядома, што канчатковы прадукт катабалізму трыптафану праз кинурениновый шлях з'яўляецца крыніцай сінтэзу NAD+ de novo.Паколькі NAD+ выпрацоўваецца галоўным чынам праз шлях выратавання, важнасць NAD+ у метабалізме трыптафану ў здароўі і хваробах яшчэ трэба вызначыць46.Наш аналіз базы дадзеных TCGA паказаў, што экспрэсія транспарцёра растворанага рэчыва трыптафану 7A5 (SLC7A5) была значна павялічана пры аденокарциноме лёгкага ў параўнанні з нармальным кантролем і станоўча карэлявала з экспрэсіяй глікалітычнага фермента GAPDH.Папярэднія даследаванні ў асноўным былі сканцэнтраваны на ролі катабалізму трыптафану ў падаўленні супрацьпухліннага імуннага адказу40,41,42.Тут мы дэманструем, што інгібіраванне паглынання трыптафану шляхам накдаўну SLC7A5 у клетках рака лёгкіх прыводзіць да наступнага зніжэння клеткавага ўзроўню NAD і спадарожнага паслаблення глікалітычнай актыўнасці.Такім чынам, наша даследаванне дае біялагічную аснову для змяненняў у сыроватачна метабалізме, звязаных са злаякаснай трансфармацыяй аденокарциномы лёгкага.
Мутацыі EGFR з'яўляюцца найбольш распаўсюджанымі мутацыямі драйвера ў пацыентаў з НМРЛ.У нашым даследаванні мы выявілі, што пацыенты з мутацыяй EGFR (n = 41) мелі агульныя метабалічныя профілі, падобныя на пацыенты з дзікім тыпам EGFR (n = 31), хоць мы выявілі зніжэнне сыроватачных узроўняў некаторых пацыентаў з мутантам EGFR у пацыентаў з ацылкарнітынам.Устаноўленая функцыя ацылкарнітынаў заключаецца ў транспарціроўцы ацыльных груп з цытаплазмы ў матрыкс мітахондрый, што прыводзіць да акіслення тоўстых кіслот для атрымання энергіі 55 .У адпаведнасці з нашымі высновамі нядаўняе даследаванне таксама вызначыла падобныя профілі метаболома паміж мутантам EGFR і пухлінамі дзікага тыпу EGFR шляхам аналізу глабальнага метаболома 102 узораў тканіны аденокарциномы лёгкіх50.Цікава, што ўтрыманне ацилкарнитина было выяўлена і ў групе мутантаў EGFR.Такім чынам, ці адлюстроўваюць змены ва ўзроўні ацылкарніціну метабалічныя змены, выкліканыя EGFR, і асноўныя малекулярныя шляхі, можа заслугоўваць далейшага вывучэння.
У заключэнне наша даследаванне стварае метабалічны класіфікатар сыроваткі крыві для дыферэнцыяльнай дыягностыкі лёгачных вузельчыкаў і прапануе працоўны працэс, які можа аптымізаваць ацэнку рызыкі і палегчыць клінічнае лячэнне на аснове скрынінга КТ.
Гэта даследаванне было адобрана Камітэтам па этыцы анкалагічнага шпіталя Універсітэта Сунь Ятсена, Першай даччынай бальніцы Універсітэта Сунь Ятсена і Камітэтам па этыцы анкалагічнага шпіталя Універсітэта Чжэнчжоў.У групах адкрыццяў і ўнутранай праверкі было сабрана 174 сыроваткі ад здаровых людзей і 244 сыроваткі ад дабраякасных вузельчыкаў ад асоб, якія праходзяць штогадовыя медыцынскія агляды ў Дэпартаменце па кантролі і прафілактыцы рака Цэнтра рака Універсітэта Сунь Ятсена, і 166 дабраякасных вузельчыкаў.сыроватка.Аденокарциномы лёгкіх I стадыі былі сабраны з анкалагічнага цэнтра Універсітэта Сунь Ятсена.У кагорце знешняй праверкі было 48 выпадкаў дабраякасных вузельчыкаў, 39 выпадкаў аденокарциномы лёгкага I стадыі з Першай філіяльнай бальніцы Універсітэта Сунь Ятсена і 24 выпадкі аденокарциномы лёгкага I стадыі з анкалагічнай бальніцы Чжэнчжоў.Анкалагічны цэнтр Універсітэта Сунь Ятсена таксама сабраў 16 выпадкаў плоскоклеточного рака лёгкіх I стадыі, каб праверыць дыягнастычную здольнасць усталяванага метабалічнага класіфікатара (характарыстыкі пацыентаў паказаны ў дадатковай табліцы 5).Узоры з кагорты адкрыццяў і ўнутранай кагорты праверкі былі сабраныя ў перыяд са студзеня 2018 г. па май 2020 г. Узоры для знешняй кагорты праверкі былі сабраныя са жніўня 2021 г. па кастрычнік 2022 г. Каб мінімізаваць гендэрную прадузятасць, прыкладна роўная колькасць мужчынскіх і жаночых выпадкаў была прызначана кожнаму кагорта.Каманда адкрыцця і група ўнутранага агляду.Пол удзельнікаў быў вызначаны на аснове самасправаздачы.Інфармаваная згода была атрымана ад усіх удзельнікаў і не была прадастаўлена кампенсацыя.Суб'ектамі з дабраякаснымі вузельчыкамі былі тыя, у каго на момант аналізу вынікі КТ былі стабільнымі на працягу 2-5 гадоў, за выключэннем 1 выпадку вонкавага валідацыйнага ўзору, які быў сабраны перад аперацыяй і дыягнаставаны з дапамогай гістапаталогіі.За выключэннем хранічнага бранхіту.Выпадкі аденокарциномы лёгкага былі сабраны перад рэзекцыяй лёгкага і пацверджаны патолагаанатамічным дыягназам.Узоры крыві нашча збіралі ў прабіркі для падзелу сыроваткі без антыкаагулянтаў.Узоры крыві згортваліся на працягу 1 гадзіны пры пакаёвай тэмпературы, а затым центрифугировали пры 2851 × g на працягу 10 хвілін пры 4°C для збору супернатант сыроваткі.Аліквоты сыроваткі замарожвалі пры -80°C да экстракцыі метабалітаў.Аддзяленне прафілактыкі рака і медыцынскага абследавання анкалагічнага цэнтра Універсітэта Сунь Ятсена сабрала пул сыроваткі ад 100 здаровых донараў, уключаючы аднолькавую колькасць мужчын і жанчын ва ўзросце ад 40 да 55 гадоў.Роўныя аб'ёмы кожнага донарскага ўзору змешвалі, атрыманы пул разбівалі на аліквоты і захоўвалі пры -80°C.Сумесь сыроваткі выкарыстоўвалася ў якасці эталоннага матэрыялу для кантролю якасці і стандартызацыі дадзеных.
Эталонную сыроватку і доследныя ўзоры размарожвалі, а метабаліты экстрагавалі камбінаваным метадам экстракцыі (МТБЭ/метанол/вада) 56 .Карацей кажучы, 50 мкл сыроваткі змешвалі з 225 мкл ледзянога метанолу і 750 мкл ледзянога метил-трет-бутылавага эфіру (MTBE).Змяшайце сумесь і вытрымаеце на лёдзе 1 гадзіну.Затым узоры змешвалі і змешвалі на віхравым рэжыме з 188 мкл вады класа MS, якая змяшчае ўнутраныя стандарты (13C-лактат, 13C3-піруват, 13C-метионин і 13C6-ізалейцын, набытыя ў Cambridge Isotope Laboratories).Сумесь затым центрифугировали пры 15000 × g на працягу 10 хвілін пры 4 °C, а ніжнюю фазу пераносілі ў дзве прабіркі (125 мкл кожная) для аналізу ВХ-МС у станоўчым і адмоўным рэжымах.Нарэшце, пробу выпарваюць насуха ў высакахуткасным вакуумным канцэнтратары.
Высушаныя метабаліты аднаўлялі ў 120 мкл 80% ацэтанітрылу, змешвалі на працягу 5 хвілін і центрифугировали пры 15000 × g на працягу 10 хвілін пры 4 ° C.Супернатанты пераносілі ў шкляныя флаконы з бурштынавага шкла з мікраўстаўкамі для метаболомических даследаванняў.Немэтавы аналіз метабаламікі на платформе звышпрадукцыйнай вадкаснай храматаграфіі і мас-спектраметрыі высокага раздзялення (UPLC-HRMS).Метабаліты падзялялі з дапамогай сістэмы Dionex Ultimate 3000 UPLC і калонкі ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters).У рэжыме станоўчых іёнаў рухомыя фазы складаліся з 95% (A) і 50% ацэтанітрылу (B), кожная з якіх утрымлівала 10 ммоль/л ацэтату амонія і 0,1% мурашынай кіслаты.У адмоўным рэжыме рухомыя фазы А і В ўтрымлівалі 95% і 50% ацэтанітрылу адпаведна, абедзве фазы ўтрымлівалі 10 ммоль / л ацэтату амонія, рн = 9. Праграма градыенту была наступнай: 0-0,5 мін, 2% Б;0,5-12 мін, 2-50% B;12-14 мін, 50-98% B;14–16 мін, 98% B;16–16.1.мін, 98 –2% Б;16,1-20 мін, 2% B. Калонку падтрымлівалі пры 40 °C, а ўзор - пры 10 °C у аўтасамплеры.Хуткасць патоку складала 0,3 мл / мін, аб'ём ін'екцыі - 3 мкл.Мас-спектрометр Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) з крыніцай іянізацыі з электрараспыленнем (ESI) працаваў у рэжыме поўнага сканавання і ў спалучэнні з рэжымам маніторынгу ddMS2 для збору вялікіх аб'ёмаў даных.Параметры MS былі ўстаноўлены наступным чынам: напружанне распылення +3,8 кВ / - 3,2 кВ, тэмпература капіляра 320 ° C, ахоўны газ 40 арб, дапаможны газ 10 арб, тэмпература награвальніка зонда 350 ° C, дыяпазон сканавання 70-1050 м / г, дазвол.70 000. Дадзеныя былі атрыманы з дапамогай Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Для ацэнкі якасці дадзеных былі атрыманы аб'яднаныя ўзоры кантролю якасці (QC) шляхам выдалення 10 мкл аліквот супернатанта з кожнага ўзору.Шэсць ін'екцый узораў кантролю якасці былі прааналізаваны ў пачатку аналітычнай паслядоўнасці для ацэнкі стабільнасці сістэмы UPLC-MS.Затым у партыю перыядычна ўводзяцца ўзоры кантролю якасці.Усе 11 партый узораў сыроваткі ў гэтым даследаванні былі прааналізаваны з дапамогай ВХ-МС.Аліквоты сумесі пулу сыроваткі ад 100 здаровых донараў выкарыстоўваліся ў якасці эталоннага матэрыялу ў адпаведных партыях для маніторынгу працэсу экстракцыі і рэгулявання эфектаў ад партыі да партыі.Немэтавы метабаламічны аналіз кагорты адкрыццяў, унутранай кагорты праверкі і знешняй кагорты праверкі быў праведзены ў Метабаламічным цэнтры Універсітэта Сунь Ятсена.Знешняя лабараторыя Цэнтра аналізу і выпрабаванняў Тэхналагічнага ўніверсітэта Гуандун таксама прааналізавала 40 узораў з знешняй кагорты, каб праверыць прадукцыйнасць мадэлі класіфікатара.
Пасля экстракцыі і аднаўлення было вымерана абсалютнае колькаснае вызначэнне метабалітаў у сыроватцы з дапамогай звышвысокаэфектыўнай вадкаснай храматаграфіі з тандэмнай мас-спектраметрыяй (тройны квадруполь Agilent 6495) з крыніцай іянізацыі з электрараспыленнем (ESI) у рэжыме маніторынгу множных рэакцый (MRM).Калонка ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Уотэрс) выкарыстоўвалася для падзелу метабалітаў.Рухомая фаза складалася з 90% (А) і 5% ацэтанітрылу (Б) з 10 ммоль / л ацэтату амонія і 0,1% раствора аміяку.Праграма градыенту была наступнай: 0-1,5 мін, 0% B;1,5-6,5 мін, 0-15% B;6,5–8 мін, 15% B;8–8,5 мін, 15%–0% B;8,5–11,5 мін, 0%B.Калонку падтрымлівалі пры 40 °C, а ўзор - пры 10 °C у аўтасамплеры.Хуткасць патоку была 0,3 мл / мін, а аб'ём ін'екцыі - 1 мкл.Параметры МС былі ўсталяваны наступным чынам: напружанне капіляра ±3,5 кВ, ціск распыляльніка 35 фунтаў на квадратны дюйм, паток абалонкавага газу 12 л/мін, тэмпература абалонкавага газу 350 °C, тэмпература сушыльнага газу 250 °C і паток сушыльнага газу 14 л/мін.MRM канверсіі трыптафану, пирувата, лактата, гипоксантина і ксантина былі 205,0-187,9, 87,0-43,4, 89,0-43,3, 135,0-92,3 і 151,0-107.9 адпаведна.Дадзеныя збіраліся з дапамогай Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Для ўзораў сыроваткі крыві трыптафан, піруват, лактат, гіпаксанцін і ксанцін колькасна вызначалі з дапамогай калібравальных крывых стандартных раствораў сумесі.Для клеткавых узораў ўтрыманне трыптафану нармалізавалі па ўнутраным стандарту і масе бялку клеткі.
Пікавую экстракцыю (m/z і час утрымання (RT)) праводзілі з выкарыстаннем Compound Discovery 3.1 і TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Для ліквідацыі розніцы патэнцыялаў паміж партыямі кожны характэрны пік доследнага ўзору быў падзелены на характэрны пік эталоннага матэрыялу з той жа партыі, каб атрымаць адносную колькасць.Адносныя стандартныя адхіленні ўнутраных стандартаў да і пасля стандартызацыі паказаны ў дадатковай табліцы 6. Адрозненні паміж дзвюма групамі характарызаваліся частатой ілжывых адкрыццяў (FDR<0,05, рэйтынгавы тэст Уілкаксана са знакам) і кратнасцю змены (>1,2 або <0,83).Неапрацаваныя дадзеныя MS аб вынятых асаблівасцях і эталонныя дадзеныя MS з карэкцыяй сыроваткі паказаны ў дадатковых дадзеных 1 і дадатковых дадзеных 2 адпаведна.Пікавая анатацыя была выканана на аснове чатырох вызначаных узроўняў ідэнтыфікацыі, уключаючы выяўленыя метабаліты, меркавана анатаваныя злучэнні, меркавана ахарактарызаваныя класы злучэнняў і невядомыя злучэнні 22 .На аснове пошуку ў базе дадзеных у Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), біялагічныя злучэнні з MS/MS, якія адпавядаюць пацверджаным стандартам, або анатацыі з дакладным супадзеннем у mzCloud (ацэнка> 85) або Chemspider былі нарэшце выбраны ў якасці прамежкавых паміж дыферэнцыяльным метаболомам.Пікавыя анатацыі для кожнай асаблівасці ўключаны ў дадатковыя даныя 3. MetaboAnalyst 5.0 выкарыстоўваўся для аднамернага аналізу колькасці метабалітаў, нармаванага па суме.MetaboAnalyst 5.0 таксама ацаніў аналіз узбагачэння шляху KEGG на аснове значна розных метабалітаў.Аналіз галоўных кампанентаў (PCA) і дыскрымінантны аналіз частковых найменшых квадратаў (PLS-DA) былі прааналізаваны з дапамогай праграмнага пакета ropls (v.1.26.4) з нармалізацыяй стэка і аўтамаштабаваннем.Аптымальная мадэль метабалітных біямаркераў для прагназавання злаякаснасці вузельчыкаў была створана з дапамогай бінарнай лагістычнай рэгрэсіі з найменшым абсалютным скарачэннем і аператарам выбару (LASSO, пакет R v.4.1-3).Прадукцыйнасць дыскрымінантнай мадэлі ў наборах выяўлення і праверкі характарызавалася ацэнкай AUC на аснове аналізу ROC у адпаведнасці з пакетам pROC (v.1.18.0.).Аптымальнае адсячэнне верагоднасці было атрымана на аснове максімальнага індэкса Юдэна мадэлі (адчувальнасць + спецыфічнасць - 1).Узоры са значэннямі меншымі або большымі за парогавае значэнне будуць прагназаваны як дабраякасныя вузельчыкі і аденокарцинома лёгкага адпаведна.
Клеткі A549 (# CCL-185, Амерыканская калекцыя тыпавых культур) вырошчвалі ў асяроддзі F-12K, якая змяшчае 10% FBS.Кароткія паслядоўнасці шпількавай РНК (shRNA), накіраваныя на SLC7A5 і ненацэлены кантроль (NC), былі ўстаўлены ў лентывірусны вектар pLKO.1-puro.Антысэнсавыя паслядоўнасці shSLC7A5 наступныя: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Антыцелы да SLC7A5 (№ 5347) і тубуліну (№ 2148) былі набыты ў кампаніі Cell Signaling Technology.Антыцелы да SLC7A5 і тубуліну выкарыстоўвалі ў развядзенні 1:1000 для Вестэрн-блот аналізу.
Глікалітычны стрэс-тэст Seahorse XF вымярае ўзроўні пазаклеткавага падкіслення (ECAR).У аналізе паслядоўна ўводзілі глюкозу, алігаміцын А і 2-DG для праверкі глікалітычнай здольнасці клетак, вымеранай з дапамогай ECAR.
Клеткі A549, трансфікаваныя ненацэленым кантролем (NC) і shSLC7A5 (Sh1, Sh2), высаджвалі на ноч у посуд дыяметрам 10 см.Метабаліты клетак экстрагировали 1 мл ледзянога 80% воднага метанолу.Клеткі ў растворы метанолу саскрабалі, збіралі ў новую прабірку і центрифугировали пры 15000 × g на працягу 15 хвілін пры 4 ° С.Збярыце 800 мкл супернатанта і высушыце з дапамогай высокахуткаснага вакуумнага канцэнтратара.Затым высушаныя гранулы метабалітаў аналізавалі на ўзровень трыптафану з дапамогай ВХ-МС/МС, як апісана вышэй.Клеткавыя ўзроўні NAD(H) у клетках A549 (NC і shSLC7A5) вымяраліся з выкарыстаннем колькаснага каларыметрычнага набору NAD+/NADH (#K337, BioVision) у адпаведнасці з інструкцыямі вытворцы.Для кожнай пробы вымяралі ўзровень бялку, каб нармалізаваць колькасць метабалітаў.
Для папярэдняга вызначэння памеру выбаркі не выкарыстоўваліся статыстычныя метады.Папярэднія метабаломічныя даследаванні, накіраваныя на адкрыццё біямаркераў15,18, лічыліся эталонамі для вызначэння памеру, і ў параўнанні з гэтымі справаздачамі наша выбарка была адэкватнай.Ніякія ўзоры не былі выключаны з кагорты даследавання.Узоры сыроваткі былі выпадковым чынам размеркаваны ў групу адкрыцця (306 выпадкаў, 74,6%) і групу ўнутранай праверкі (104 выпадкі, 25,4%) для нецэлеўных даследаванняў метабаламікі.Мы таксама выпадковым чынам адабралі 70 выпадкаў з кожнай групы з набору адкрыццяў для мэтавых даследаванняў метабаламікі.Даследчыкі не ведалі размеркавання груп падчас збору і аналізу дадзеных ВХ-МС.Статыстычны аналіз метабаломічных даных і клеткавых эксперыментаў апісаны ў адпаведных раздзелах Вынікі, Легенды малюнкаў і Метады.Колькасная ацэнка клеткавага трыптафану, NADT і глікалітычнай актыўнасці была праведзена тры разы незалежна з аднолькавымі вынікамі.
Для атрымання дадатковай інфармацыі аб дызайне даследавання гл. Анатацыю справаздачы аб натуральным партфоліо, звязаную з гэтым артыкулам.
Неапрацаваныя дадзеныя MS па вынятых прыкметах і нармалізаваныя дадзеныя MS эталоннай сыроваткі паказаны ў дадатковых дадзеных 1 і дадатковых дадзеных 2 адпаведна.Пікавыя анатацыі для дыферэнцыяльных функцый прадстаўлены ў дадатковых дадзеных 3. Набор даных LUAD TCGA можна загрузіць з https://portal.gdc.cancer.gov/.Зыходныя даныя для пабудовы графіка прадстаўлены ў зыходных даных.Для гэтага артыкула прыведзены зыходныя дадзеныя.
Нацыянальная даследчая група па скрынінгу лёгкіх і г.д. Зніжэнне смяротнасці ад раку лёгкіх з дапамогай кампутарнай тамаграфіі з нізкімі дозамі.Паўночная Англія.J. Med.365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберл, Д.Р. і Прарок, ПК. Скрынінг рака лёгкіх з выкарыстаннем нізкадознай спіральнай КТ: вынікі Нацыянальнага скрынінгавага даследавання лёгкіх (NLST).J. Med.Экран 18, 109–111 (2011).
Дэ Конінг, Х.Дж., і інш.Зніжэнне смяротнасці ад раку лёгкіх з аб'ёмным скрынінгам КТ у рандомізірованное даследаванні.Паўночная Англія.J. Med.382, 503–513 (2020).
Час публікацыі: 18 верасня 2023 г